乙烯、多胺对杏鲍菇采后衰老的调控及PeSAMDC基因初探

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杏鲍菇(Pleurotus eryngii)是一种药食两用型食用菌,其菌肉肥厚、味道鲜美、氨基酸种类齐全,具有较高营养及药用价值,逐渐受到消费者的青睐。但杏鲍菇含水量高,采后生理代谢旺盛,菇体表面无保护结构,导致其常温极不耐贮藏,易出现失水软化、组织褐变、变黏发臭等品质衰败现象。因此,深入探讨杏鲍菇采后成熟衰老机制,可为提高杏鲍菇采后品质、延长货架期提供理论参考。乙烯作为成熟衰老的关键调控因子,在呼吸跃变型及非跃变型果蔬成熟衰老中均起重要的调控作用;多胺是一类广泛存在于生物体内,具较强生物活性的低分子脂肪族含氮碱,逆境胁迫下对细胞膜保护系统具有重要影响,可起到延缓果蔬衰老的作用。乙烯与多胺具有共同前体物质S-腺苷蛋氨酸(SAM),生理功能却相反,两者对采后衰老的调控作用近年来受到广泛重视。然而,乙烯和多胺在杏鲍菇子实体衰老过程中分别扮演什么角色尚不清楚。因此,本论文分别探讨了乙烯、多胺对杏鲍菇采后衰老过程的影响,同时克隆获得杏鲍菇多胺合成关键酶S-腺苷蛋氨酸基因SAMDC(PeSAMDC)并对其进行了初步探索。研究结果分述如下:(1)采用气相色谱法测定采后贮藏期间杏鲍菇子实体内源乙烯释放规律,以及不同浓度(0、1、10、100、1000μL/L)外源乙烯对其内源乙烯含量和衰老进程的影响。结果表明,采后乙烯释放量随子实体的继续发育逐渐增加,分别在贮藏的12 h和36 h出现两次释放高峰,释放量分别为贮藏前的12.53和7.57倍;同时外源乙烯可不同程度诱导内源乙烯的释放,加剧子实体多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的上升及褐变程度,抑制相对电导率和丙二醛(MDA)含量的降低,加快可溶性糖及蛋白的降解,促进抗氧化酶[抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)]活性的降低,加剧二苯基苦基苯肼(DPPH)清除率、总抗氧化能力(TAC)和抗氧化物质(总酚、类黄酮)的下降,由此说明乙烯可加速杏鲍菇子实体的采后衰老。(2)通过采前喷施外源多胺(1 mmol/L Spd、Spm),研究其对杏鲍菇采后贮藏期间内源多胺(Spd、Spm)、乙烯释放量、细胞膜系统及贮藏品质的影响。结果表明,采前喷施外源Spd、Spm可促进子实体内源多胺积累,延缓丙二醛及细胞膜相对透性的上升,降低活性氧水平,维持较高的SAMDC活性,并使乙烯与多胺的比值(E/Spd及E/Spm)处于较低水平,加速S-腺苷蛋氨酸(SAM)更多的转向多胺合成方向,抑制乙烯释放,维持子实体较高的贮藏品质。由此说明,多胺可延缓杏鲍菇子实体的采后衰老。(3)以0.6 mol/L MgSO4为渗透压稳定剂,2.0%溶壁酶酶解液于31℃ 120 rpm酶解菌丝体2.0 h,成功制备杏鲍菇原生质体;通过潮霉素抗性实验,确定杏鲍菇菌丝及原生质体对潮霉素的抗性筛选浓度为60μg/mL;采用PEG/CaC12介导法将质粒pYf11-hph(该质粒含标记基因:潮霉素抗性基因hph,报告基因:增强型绿色荧光蛋白egfp,强启动子:RP27)转化杏鲍菇原生质体,随机挑取17个转化子经hph抗性筛选、PCR及荧光定量PCR检测证实标记基因hph已成功转化杏鲍菇基因组,同时转化子在荧光倒置显微镜下可观察到菌丝体发出的绿色荧光,由此优化了杏鲍菇原生质体遗传转化体系。(4)通过序列比对克隆获得杏鲍菇PeSAMDC基因,该基因全长1318 bp,编码423个氨基酸;并利用基因重组技术将PeSAMDC基因插入质粒pYf11-hph的强启动子RP27位点之后成功组建PeSAMDC过表达载体pYf11-hph-PeSAMDC,经PEG/CaC12介导法将其转化杏鲍菇原生质体,通过hph抗性筛选、PCR及荧光定量PCR证实外源PeSAMDC已成功转化杏鲍菇,并获得PeSAMDC过表达菌株,同时经出菇试验得到过表达子实体。
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