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上皮性卵巢恶性肿瘤(Ovarian cancer OC)，目前是在女性相关恶性肿瘤中侵袭性和致死率最高的恶性肿瘤，是发展中国家女性生殖系统恶性肿瘤中死亡率最高的癌症。由于卵巢癌特有的生物学行为，患者早期症状不明显，多数病人来院就诊时已是Ⅲ-Ⅳ期，在临床上无法得到满意的治疗效果。研究认为，OC患者原发病灶形成后，肿瘤快速生长繁殖，相互挤压，使得肿瘤细胞从卵巢表面脱落，随即种植在腹膜表面的一些缺损处。这些脱落的肿瘤细胞可以以单个细胞的形式在种植处继续生长，也可以形成多细胞聚合体浮游于腹水中，随腹水粘附种植于盆腹腔远处的其他脏器，形成新的病灶。这些肿瘤的生长，同时伴随着异生血管的形成，产生了无数的新生血管网，由于毛细血管通透性增加、渗透面积增加，因而产生大量癌性腹水。再通过腹水远处播散癌细胞至大网膜、膈肌、肝脏以及肠间隙，反复种植、恶性循环。因而卵巢癌的死亡率与广泛的肿瘤转移和盆腹腔腹水的渗出有着紧密联系。近几年来，虽然卵巢癌的在综合治疗上有了较大的进步，但整体5年存活率仍不到45%，因此仍然是临床妇科肿瘤医生尤为关注重视的研究项目之一。
多肽组学作为近几年来的一门新兴学科，已经在不同的医学领域，取得了显著的进展。多肽类物质在疾病生理、病理进展过程中可以发挥重要的调节作用，从而控制着疾病的发生和发展。目前在血液样本研究中，多肽组学分析已经开展了近十余年，然而由于血液中富含有血清蛋白、纤维蛋白原、免疫球蛋白，这些蛋白的混合存在影响了对内源性功能多肽的测定和对多肽发生调节功能机制的了解。所以越来越多的多肽研究转向了局部微环境下的体液分析，比如尿液、脑脊液、乳液和淋巴液等等，取得了显著的研究成果。卵巢癌作为妇科难治性恶性肿瘤，有条件和也有需求在这一领域有所突破。我们知道卵巢癌细胞产生的恶性腹水作为肿瘤存在的局部微环境，隐藏着丰富肿瘤细胞和异常蛋白因子，从恶性腹水中得到精确的肽学信息，极有可能会对了解卵巢癌的发生、发展起到非常重要的作用，有助于提高卵巢癌早期诊断的成功率和开创卵巢癌相关治疗突破的途径。本研究收集了自2015年1月至2015年12月在我院(南京医科大学第一附属医院暨江苏省妇幼保健院)妇科行腹腔镜探查手术而确诊的卵巢上皮性癌和妇科良性肿瘤患者各6例(年龄在30-60岁间)，取手术中腹水样本2ml，进行多肽学分析。获得两者的差异性肽，再通过质谱分析等方法来了解这些独特的内生性多肽的生物学特性，并揭示他们在卵巢癌病理发生发展过程中的作用机制。
研究目的对卵巢癌患者和妇科良性肿瘤患者腹水中的多肽成分进行分析，对所筛查的差异性肽进一步做理化分析，总结评估差异性多肽在卵巢癌腹水中的生物学特性。预测具有明显特性的目的多肽可能对卵巢癌发生发展的干预机制，了解多肽与前体蛋白的相互依存关系。为实现卵巢癌的早发现、早诊断提供新的参考标准，也为卵巢癌的多元化治疗开拓了新的思路。
研究方法
第一部分：
1、提取卵巢癌组和妇科良性肿瘤组腹水样本。
2、运用液相色谱串联质谱技术(Tandem Mass Tag，TMT)检测卵巢癌(OC)组和妇科良性肿瘤(NC)组的内源性多肽的表达情况，并对检测所得数据进行统计学分析，以2倍以上变化及且具有统计学意义(P＜0.05)为标准，筛选出具有差异性表达的多肽。
3、对差异表达的相关多肽进行理化性质分析，对其前体蛋白进行GO(Gene Ontology)和pathway分析。
4、运用IPA和UniProt网络数据库进一步探究所得差异多肽在前体蛋白的位置及前体蛋白的功能，筛选出与卵巢癌发生发展可能密切相关内源性多肽。
第二部分：
1、生物信息学方法进一步分析挑选出的KMT2A-P和CSF1R-P2肽的特征。
2、CCK8实验分析比较KMT2A-P1肽和CSF1R-P2肽对卵巢癌细胞株的增殖能力的影响。
3、细胞划痕实验分析比较KMT2A-P1肽和CSF1R-P2肽对卵巢癌细胞株迁移能力的影响
4、Transwell实验分析比较KMT2A-P1肽和CSF1R-P2肽对卵巢癌细胞株侵袭能力的影响。
5、对比较所得的优势肽进行western-blot实验，了解其对卵巢癌细胞作用中参与的信号蛋白通路。
研究结果
第一部分：12组腹水样本中共测有4388个肽，其中104个肽具有显著性差异(P＜0.05)，用液相质谱分析仪对这些差异性肽做生物学分析表明，52个肽呈上调功能和52个肽显示为下调功能(foldchange＞2)。在线PI/MW软件对104条肽继续做生物、理化分析，显示这些肽的分子量主要集中在500-2000Da(90%)，其中有40%分布在500-900Da之间。在这些多肽前体蛋白中有30%的等电点位于5-6之间，有17%的肽首位氨基酸是赖氨酸(Lysine K)，末尾氨基酸主要是脯氨酸(Proline P)，占了所有末尾氨基酸的14%。GO分析显示共有5条通路参与了卵巢癌的形成：蛋白激酶A通路、卵巢癌固有信号通路、AMPK通路、JAK/Stat信号通路、PI3K/Akt信号通路。对倍数变化大于5，P值小于0.05(foldchange＞5，P＜0.05)的17条多肽利用在线工具SMART分析其前体蛋白组成及功能结构域的鉴定，发现有如下2条多肽：VLTALLNSR(Q03164/KMT2A )和VAARNVLLTNGHVAK(P07333/CSF1R)，这两条肽位于其前体蛋白KMT2A、CSF1R的稳定功能区域内。
第二部分：CCK8细胞增殖实验结果显示：在卵巢癌细胞株SKOV3和8910中，加入递增浓度的KMT2A-P1肽和CSF1R-P2肽作用48、72h，KMT2A-P1肽较CSF1R-P2肽对二种细胞株具有更明显的增殖效应，差异有统计学意义(P＜0.05)，100μmol/L和125μmol/L的浓度结果比较，两者差异无统计学意义(P＞0.05)。细胞划痕实验显示：应用KMT2A-P1多肽处理卵巢癌SKOV3细胞和8910细胞在划痕后，48h时测得平均划痕面积改变率为：62.67%±2.05%和52.5%±2.29%，明显高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.001)。经CSF1R-P2多肽划痕后的细胞，48h平均划痕面积为：37.67%±3.86%和45.0%±1.87%。与对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。Transwell侵袭实验结果显示：48h后经KMT2A-P1和CSF1R-P2处理过的SKOV3细胞200倍视野平均穿膜细胞数量分别为：KMT2A-P1(249.5±8.2个)和CSF1R-P2(96.75±5.9个)，对照组(NC)为(100.5±8.3个)。经KMT2A-P1处理的细胞其侵袭性改变较NC组差异有统计学意义(P＜0.001)。在卵巢癌细胞8910中，Transwell实验结果显示：48h后NC(126.0±8.7个)、KMT2A-P1(267.2±8.3个)和CSF1R-P2(121.0±7.9个)。KMT2A-P1多肽表现出明显的卵巢癌细胞侵袭力，而CSF1R-P2未见有明显的侵袭作用。进一步对KMT2A-P1干预下的细胞信号通路进行了western-blot实验，结果显示：PI3K/AKT信号通路中P-PI3K及P-AKT蛋白增加，EMT信号通路的E-Cadherin蛋白降低，Vimentin蛋白增加，提示KMT2A-P1多肽可能能过PI3K/AKT、EMT信号通路促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。
结论
第一部分：腹水样本104条差异多肽参与了与卵巢癌密切相关的5条信号通路，预示着这些肽与卵巢癌有着可能的联系。通过筛选得到的VLTALLNSR和VAARNVLLTNGHVAK二条多肽，分别位于其前体蛋白表面KMT2A和CSF1R的生物功能区域(BROMO和TyrKc区域)，发挥功能的多肽影响着前体蛋白的生物学效应，并作用在与恶性肿瘤相关的机体调节中，导致调节失衡，促进恶性肿瘤的发生。
第二部分：人工合成的多肽KMT2A-P1和CSF1R-P2作用在卵巢癌细胞株SKOV3和8910中，表现出不同的特性，KMT2A-P1较CSF1R-P2对细胞产生明显的增殖、迁移和侵袭作用，并且KMT2A-P1可能通过PI3K/AKT信号通路和EMT信号通路，来达到促进肿瘤细胞生长和转移的作用。
多肽组学作为近几年来的一门新兴学科，已经在不同的医学领域，取得了显著的进展。多肽类物质在疾病生理、病理进展过程中可以发挥重要的调节作用，从而控制着疾病的发生和发展。目前在血液样本研究中，多肽组学分析已经开展了近十余年，然而由于血液中富含有血清蛋白、纤维蛋白原、免疫球蛋白，这些蛋白的混合存在影响了对内源性功能多肽的测定和对多肽发生调节功能机制的了解。所以越来越多的多肽研究转向了局部微环境下的体液分析，比如尿液、脑脊液、乳液和淋巴液等等，取得了显著的研究成果。卵巢癌作为妇科难治性恶性肿瘤，有条件和也有需求在这一领域有所突破。我们知道卵巢癌细胞产生的恶性腹水作为肿瘤存在的局部微环境，隐藏着丰富肿瘤细胞和异常蛋白因子，从恶性腹水中得到精确的肽学信息，极有可能会对了解卵巢癌的发生、发展起到非常重要的作用，有助于提高卵巢癌早期诊断的成功率和开创卵巢癌相关治疗突破的途径。本研究收集了自2015年1月至2015年12月在我院(南京医科大学第一附属医院暨江苏省妇幼保健院)妇科行腹腔镜探查手术而确诊的卵巢上皮性癌和妇科良性肿瘤患者各6例(年龄在30-60岁间)，取手术中腹水样本2ml，进行多肽学分析。获得两者的差异性肽，再通过质谱分析等方法来了解这些独特的内生性多肽的生物学特性，并揭示他们在卵巢癌病理发生发展过程中的作用机制。
研究目的对卵巢癌患者和妇科良性肿瘤患者腹水中的多肽成分进行分析，对所筛查的差异性肽进一步做理化分析，总结评估差异性多肽在卵巢癌腹水中的生物学特性。预测具有明显特性的目的多肽可能对卵巢癌发生发展的干预机制，了解多肽与前体蛋白的相互依存关系。为实现卵巢癌的早发现、早诊断提供新的参考标准，也为卵巢癌的多元化治疗开拓了新的思路。
研究方法
第一部分：
1、提取卵巢癌组和妇科良性肿瘤组腹水样本。
2、运用液相色谱串联质谱技术(Tandem Mass Tag，TMT)检测卵巢癌(OC)组和妇科良性肿瘤(NC)组的内源性多肽的表达情况，并对检测所得数据进行统计学分析，以2倍以上变化及且具有统计学意义(P＜0.05)为标准，筛选出具有差异性表达的多肽。
3、对差异表达的相关多肽进行理化性质分析，对其前体蛋白进行GO(Gene Ontology)和pathway分析。
4、运用IPA和UniProt网络数据库进一步探究所得差异多肽在前体蛋白的位置及前体蛋白的功能，筛选出与卵巢癌发生发展可能密切相关内源性多肽。
第二部分：
1、生物信息学方法进一步分析挑选出的KMT2A-P和CSF1R-P2肽的特征。
2、CCK8实验分析比较KMT2A-P1肽和CSF1R-P2肽对卵巢癌细胞株的增殖能力的影响。
3、细胞划痕实验分析比较KMT2A-P1肽和CSF1R-P2肽对卵巢癌细胞株迁移能力的影响
4、Transwell实验分析比较KMT2A-P1肽和CSF1R-P2肽对卵巢癌细胞株侵袭能力的影响。
5、对比较所得的优势肽进行western-blot实验，了解其对卵巢癌细胞作用中参与的信号蛋白通路。
研究结果
第一部分：12组腹水样本中共测有4388个肽，其中104个肽具有显著性差异(P＜0.05)，用液相质谱分析仪对这些差异性肽做生物学分析表明，52个肽呈上调功能和52个肽显示为下调功能(foldchange＞2)。在线PI/MW软件对104条肽继续做生物、理化分析，显示这些肽的分子量主要集中在500-2000Da(90%)，其中有40%分布在500-900Da之间。在这些多肽前体蛋白中有30%的等电点位于5-6之间，有17%的肽首位氨基酸是赖氨酸(Lysine K)，末尾氨基酸主要是脯氨酸(Proline P)，占了所有末尾氨基酸的14%。GO分析显示共有5条通路参与了卵巢癌的形成：蛋白激酶A通路、卵巢癌固有信号通路、AMPK通路、JAK/Stat信号通路、PI3K/Akt信号通路。对倍数变化大于5，P值小于0.05(foldchange＞5，P＜0.05)的17条多肽利用在线工具SMART分析其前体蛋白组成及功能结构域的鉴定，发现有如下2条多肽：VLTALLNSR(Q03164/KMT2A )和VAARNVLLTNGHVAK(P07333/CSF1R)，这两条肽位于其前体蛋白KMT2A、CSF1R的稳定功能区域内。
第二部分：CCK8细胞增殖实验结果显示：在卵巢癌细胞株SKOV3和8910中，加入递增浓度的KMT2A-P1肽和CSF1R-P2肽作用48、72h，KMT2A-P1肽较CSF1R-P2肽对二种细胞株具有更明显的增殖效应，差异有统计学意义(P＜0.05)，100μmol/L和125μmol/L的浓度结果比较，两者差异无统计学意义(P＞0.05)。细胞划痕实验显示：应用KMT2A-P1多肽处理卵巢癌SKOV3细胞和8910细胞在划痕后，48h时测得平均划痕面积改变率为：62.67%±2.05%和52.5%±2.29%，明显高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.001)。经CSF1R-P2多肽划痕后的细胞，48h平均划痕面积为：37.67%±3.86%和45.0%±1.87%。与对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。Transwell侵袭实验结果显示：48h后经KMT2A-P1和CSF1R-P2处理过的SKOV3细胞200倍视野平均穿膜细胞数量分别为：KMT2A-P1(249.5±8.2个)和CSF1R-P2(96.75±5.9个)，对照组(NC)为(100.5±8.3个)。经KMT2A-P1处理的细胞其侵袭性改变较NC组差异有统计学意义(P＜0.001)。在卵巢癌细胞8910中，Transwell实验结果显示：48h后NC(126.0±8.7个)、KMT2A-P1(267.2±8.3个)和CSF1R-P2(121.0±7.9个)。KMT2A-P1多肽表现出明显的卵巢癌细胞侵袭力，而CSF1R-P2未见有明显的侵袭作用。进一步对KMT2A-P1干预下的细胞信号通路进行了western-blot实验，结果显示：PI3K/AKT信号通路中P-PI3K及P-AKT蛋白增加，EMT信号通路的E-Cadherin蛋白降低，Vimentin蛋白增加，提示KMT2A-P1多肽可能能过PI3K/AKT、EMT信号通路促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。
结论
第一部分：腹水样本104条差异多肽参与了与卵巢癌密切相关的5条信号通路，预示着这些肽与卵巢癌有着可能的联系。通过筛选得到的VLTALLNSR和VAARNVLLTNGHVAK二条多肽，分别位于其前体蛋白表面KMT2A和CSF1R的生物功能区域(BROMO和TyrKc区域)，发挥功能的多肽影响着前体蛋白的生物学效应，并作用在与恶性肿瘤相关的机体调节中，导致调节失衡，促进恶性肿瘤的发生。
第二部分：人工合成的多肽KMT2A-P1和CSF1R-P2作用在卵巢癌细胞株SKOV3和8910中，表现出不同的特性，KMT2A-P1较CSF1R-P2对细胞产生明显的增殖、迁移和侵袭作用，并且KMT2A-P1可能通过PI3K/AKT信号通路和EMT信号通路，来达到促进肿瘤细胞生长和转移的作用。