阿尔茨海默病重组基因工程亚单位疫苗研究

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阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)作为神经退行性疾病的一种,它主要导致患者的认知能力和学习记忆能力的迅速下降,从而给患者带来了身体和心理的双重压力,同时给家庭和社会也带来了经济负担。目前阿尔茨海默病的发病率越来越高,患病人数越来越多,全球各个国家已经引起高度重视,科研工作者正在尝试研发各种药物来预防和治疗此疾病。关于阿尔茨海默病的发病原因目前有很多观点,认可度最高的是淀粉样蛋白级联假说,该理论认为APP蛋白的异常降解导致患者大脑中产生大量可溶性Aβ42或Aβ40肽,其进一步的聚集导致了大脑内堆积大量的淀粉样斑块,并引起Tau蛋白的积累形成神经纤维的过度缠结,导致离子失去平衡进而引起神经元细胞的坏死。近来大量研究证明,AD发病的一个重要的可能原因是体内积累的β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)寡聚体产生的神经毒性,导致神经元损伤和功能的衰退,出现记忆和认知功能的障碍,所以以Aβ作为靶标包括主动免疫和被动免疫的治疗方案便应运而生。靶向Aβ的AN-1792疫苗临床试验失败的原因是Aβ42肽的T细胞表位引发了自身毒性的T细胞免疫反应,所以本研究采用人源Aβ42的B细胞表位Aβ15多肽12拷贝重复串联以模拟Aβ寡聚体结构特性,并融合辅助T细胞表位构建了重组融合抗原12Aβ15-TF;该重组融合抗原可能能够避免引起自身免疫反应,保证疫苗的安全性,也能特异地清除具毒性的Aβ寡聚体以达到防治AD的目的。将以上编码12Aβ15-TF抗原的基因克隆入原核表达载体pTIG-Trx中,随后对原核表达的重组蛋白进行纯化以得到高纯度的重组蛋白抗原。以本实验室先前制备的候选6Aβ15-TF作为平行对照,将其作为亚单位疫苗并联合Al佐剂免疫普通C57BL/6小鼠,测定免疫后小鼠的体液免疫水平以及细胞免疫水平,确定该疫苗的免疫原性。实验结果显示,重组亚单位疫苗联合Al佐剂对小鼠进行四次免疫后,免疫组的小鼠体内产生了高的抗Aβ42的特异性抗体,最高抗体滴度可以达到1:40000左右。抗体亚型的测定结果表明这两种疫苗产生的抗体亚型主要是IgG1,并伴随着一定数量的IgG2b,所以产生的免疫反应均主要是Th2型体液免疫应答反应。淋巴细胞增殖结果表明,免疫后的C57BL/6小鼠主要产生针对辅助性T细胞表位特异性的细胞免疫反应,没有产生针对Aβ42的T淋巴细胞免疫反应。这些结果提示此亚单位疫苗产生的抗体反应可能能够特异性的中和或者清除体内的Aβ42分子,达到缓解或治疗阿尔茨海默病的作用。利用Al佐剂联合6Aβ15-TF和12Aβ15-TF两种重组表位嵌合抗原在3×Tg-AD模型小鼠身上进行疫苗免疫治疗效果的研究,5次免疫后测定血清抗体水平,结果表明免疫后3×Tg-AD模型小鼠体内也产生了较高水平的针对Aβ42肽的抗体,抗体水平可以在体内维持较长的时间;对抗体亚型测定的结果进行分析表明疫苗免疫3×Tg-AD模型小鼠后产生了较高的IgG1型抗体,并且伴随着一定量的IgG2b抗体,与免疫C57BL/6小鼠时结果相似,均产生Th2型体液免疫应答反应,因此可能不会引起Th1型免疫炎症反应。以上实验表明该重组疫苗与6Aβ15-TF一样免疫小鼠后诱导机体产生较强的Th2型体液免疫反应,这提示该疫苗在临床试验时可能不会产生Aβ42特异性Th1型免疫炎症反应,具有较好的安全性。重组表位嵌合抗原免疫后的3×Tg-AD模型小鼠在20月龄的时候进行行为学评价,结果表明3×Tg-AD模型小鼠经过疫苗治疗后,小鼠的学习记忆和认知水平有了一定的提高,提取脑组织蛋白进行AD病理相关蛋白的检测,检测结果证明治疗后的小鼠一些突触性蛋白的含量相比未治疗组小鼠发生了明显的良性变化。脑组织蛋白检测的结果表明,Dynamin1的表达量在患有AD的小鼠中有所下降,免疫组Dynamin1蛋白表达量明显高于对照组;与突触相关的PSD-95蛋白水平的表达与AD模型小鼠的病理过程呈现负相关,免疫组与对照组相比,PSD-95蛋白水平上调,表明重组表位嵌合疫苗能够很好地保护小鼠的突触功能;与对照组相比,免疫组的GluR1蛋白的含量也有了一定的上调,表明免疫组的突触功能也得到很好的保护。此外对3×Tg-AD模型小鼠脑组织内可溶性及不可溶性Aβ40、Aβ42和Tau蛋白的含量进行测定,发现经这两种疫苗免疫后模型动物脑内可溶性Aβ40、Aβ42和Tau蛋白含量明显减少,而不可溶性Tau蛋白的含量没有明显变化,并且12Aβ15-TF组比6Aβ15-TF组小鼠可溶性Aβ40、Aβ42和Tau的含量减少得更明显。总之,本研究设计与制备的12Aβ15-TF重组蛋白疫苗对AD的病情具有良好的免疫治疗效果,能够减少AD病理变化,保护突触蛋白的降解,改善行为学能力,表明它可作为一个候选疫苗用于预防或免疫治疗阿尔茨海默病。
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