背景及目的脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是平战时常见的一种严重神经系统创伤,常导致病人四肢不同程度的瘫痪或大小便障碍,不仅给病人造成痛苦,也加重社会及家庭负担。SCI在世界上总发生率20-40人/百万人/年,美国发生率为28～55人/百万人/年,每年新增病例约1万人,损伤时平均年龄为31.7岁。每年护理与治疗这些病人的总费用超过70亿美元。我国没有全面的统计,但北京市统计2002年脊髓损伤发病率为60人/百万,远高于美国和世界总体水平,随着中国经济的发展,交通、建筑及煤矿事故等导致的SCI越来越成为威胁人类健康和生活质量的首要问题。SCI所致残疾目前尚无有效治疗方法,神经功能恢复一直是临床治疗的难题,因此关于脊髓损伤与修复的研究,无论从其社会意义还是科学意义上来说都是非常必要和迫切的。当前关于脊髓损伤修复的研究取得了长足的进展,归纳起来主要有以下几方面:(1)神经保护(Neuroprotection)方面的研究,脊髓遭受创伤后除原发损伤外,更重要的是通过各种机制(如缺血缺氧、兴奋性氨基酸毒性、离子稳态失衡、钙超载、细胞凋亡及炎症等)导致继发损伤,是引起脊髓功能丧失的主要原因。原发损伤很难挽救,而继发损伤则可抢救。(2)神经再生(Neuroregeneration)的研究,此领域在上世纪90年代进展较大,主要发现中枢神经系统具有再生能力,但由于外部微环境导致神经再生受抑制,如神经再生抑制分子、胶质瘢痕及囊腔等的物理及化学性屏障。(3)神经移植(Neurotransplantation),主要通过外周神经、组织工程、(各种来源的)干细胞等的移植桥接坏死区、促进再生来修复损伤脊髓。(4)神经可塑性或神经重塑(Neuroplasticity),研究发现SCI后患者是可以自行恢复部分功能,这和脊髓自发可塑性有关,只要残留少部分的神经纤维,对脊髓功能重建的即有很大的帮助,因此临床常通过康复理疗等帮助患者脊髓功能的重建。虽然上述策略在动物实验中取得了较好的效果,但临床疗效不尽如人意,循证医学的证据显示针对继发损伤的药物,如被大家寄予厚望的NMDA受体抑制剂、神经节苷脂、自由基清除剂等均对SCI无效。由此可见促脊髓损伤修复、再生的策略之路还很遥远,因此,寻找脊髓损伤与修复新的突破点和新的治疗靶点,具有重要的医学价值和社会意义。很早人们已注意到中枢神经系统(central nervous system,CNS)损伤后,女性患者的功能恢复及预后往往较男性好,进一步的临床研究(包括流行病学调查)及动物实验也得到了类似的发现,并推广到神经创伤和神经退行性疾病(如Alzheimer’s病、Parkinson’s病),众多学者认为这主要是和雌激素有关,证明雌激素对神经损伤是具有明确的保护作用的。长期以来,可溶性细胞内雌激素受体ERα/β(ER)一直被认为是其作用的唯一受体。该类受体通过与雌激素结合,发生构象变化,并转移到核内与特定的DNA系列-雌激素反应元件(estrogen responsive element,ERE)结合,调控一系列基因的转录及表达,从而影响细胞的发育、增殖、凋亡等。此途径为雌激素的经典途径,一般耗时较长,需数小时到数天,称为雌激素的慢速基因作用。但有大量的研究显示雌激素可在数十秒、数分钟到数十分钟内起效,如调节血管张力、快速促进NO释放、Ca2+动员等。均提示雌激素除通过经典的慢速基因途径外,尚通过未被人们认识的非基因机制快速起效。在2005年Science刊文以充分的证据表明确实存在新的雌激素受体-GPR30(一种G蛋白耦联受体)介导了雌激素的快速作用途径,因此作为介导雌激素快速作用的膜受体在雌激素对脊髓损伤的保护作用中可能是具有重要作用的,是脊髓损伤修复研究的一个重要的新靶点。目的1.观察GPR30在正常大鼠脊髓内的空间的分布规律和在脊髓细胞上的表达情况。2.了解SCI后经E2、E2-BSA、G-1、生理盐水干预后大鼠的运动功能恢复情况及GPR30的蛋白表达情况。方法1.本课题以成年雌性SD大鼠为研究对象,对正常成年大鼠脊髓进行形态学研究:用免疫组化染色的方法,观察GPR30在脊髓的颈、胸、腰、骶各节段的空间分布特点;运用免疫荧光双标记法观察GPR30在大鼠脊髓中的细胞定位,探讨GPR30在脊髓损伤中可能起到的作用。2.建立脊髓打击伤实验模型,围绕正常组、SCI组、SCI+E2组、SCI+E2-BSA组、SCG-1组之间的对比进行以下研究:1)功能学研究:对各组的大鼠进行大鼠下肢运动功能评分(BBB评分),对各组结果进行比较,初步探讨GPR30在SCI中的作用。2)运用Western-blotting技术对干预各组的脊髓组织的GPR30的蛋白表达水平进行检测,比较各组间GPR30的蛋白水平变化,进一步揭示GPR30在SCI中所起的作用。结果1.GPR30在正常大鼠脊髓各节段的空间分布情况:GPR30可见在大鼠的脊髓各节段均有明确的表达,但主要表达在脊髓灰质,在白质中的分布情况各节段基本类似呈均匀分布,未见表达密集处,但在灰质中的分布存在一定的差异。GPR30在颈段脊髓灰质中主要分布在灰质的腹角,在中央管周围亦可见较多表达,在背角基本未见GPR30的表达,但在靠近背角的灰质中可见有GPR30阳性信号。GPR30在胸段脊髓灰质中仍主要在腹角分布,但在中央管周围仅见极少量分布,在背角及背角周围灰质均未见明显GPR30的阳性信号。GPR30在腰段脊髓灰质中仍主要在腹角分布,在灰质的联合部可见极少量分布,但在背角及周围灰质均可见有不少GPR30阳性信号的分布。在骶髓内可见GPR30仍主要在灰质的腹角分布且分布较稀,未见明显聚集,在灰质背角未见明显分布。从细胞结构定位来看,GPR30在脊髓各节段的灰质细胞内均在胞浆胞膜中表达,在核内没有检测到GPR30阳性信号。2.GPR30在正常大鼠脊髓细胞上的表达情况:运用免疫荧光双标染色技术,对正常大鼠脊髓染色,观察可见出GPR30在脊髓中的神经元有明确的表达,在少突胶质细胞及小胶质细胞上也有表达,但在星形胶质细胞上未见表达。3.功能学研究显示:SCI后按假手术对照、SCI组、E2组、E2-BSA组、G-1组分组给予干预后进行BBB评分,结果如下:4.用Western-blotting技术检测各干预组的GPR30蛋白表达水平结果显示:盐水组、E2组、E2-BSA组和G-1组GPR30的蛋白水平均较正常对照组高。损伤后各干预组间比较可见盐水组蛋白表达量显著低于E2组、E2-BSA组、G-1组,且盐水组的蛋白表达增长趋势同E2组是基本一致的。E2组蛋白表达水平在损伤后的初期阶段上升较慢,在第十四天左右达到最高值,此后蛋白表达水平缓慢减少,E2组在第1、3天蛋白表达水平是显著高于E2-BSA组,但是在第7天可见E2-BSA组蛋白表达水平快速增加,表达量显著超过E2组。E2-BSA组在损伤后的3天以内蛋白表达水平也上升很缓慢,但在第七天左右表达水平达到最高值。G-1组蛋白表达水平则是在损伤后的初期节段就开始快速增加,在第3天就已经显著高于其它各组,并在第7天左右达到最高值,此后蛋白表达量开始快速减少,并在第14天时开始明显低于E2组的表达水平。结论1.正常成年雄性大鼠脊髓中,雌激素膜受体GPR30在脊髓灰白质中均有表达,但主要分布在灰质中,且主要表达在脊髓腹脚运动神经元。2.正常成年雄性大鼠脊髓细胞中,GPR30在神经元的胞浆上有表达,在小胶质细胞及少突胶质细胞上也明确存在表达,而在星形胶质细胞上未见明确表达。3.在本实验条件下普通雌激素E2、结合牛血清白蛋白的雌激素E2-BSA(不透细胞膜)及GPR30特异激动剂G-1均对SCI有明确的保护作用,且G-1在SCI后早期保护效应较普通雌激素强。4.雌激素膜受体GPR30参与介导了雌激素对SCI的保护作用,但雌激素的其它途径也可能参与介导了此种效应。