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背景和目的:甲型流感病毒(IAV)致病性及传染性高,可引起季节性流感及流感大爆发。流行病学研究显示,导致疾病加重及死亡的主要原因并非流感病毒本身所引起的病毒性肺炎,而是如肺炎链球菌(Sp),嗜血性流感菌,金黄色葡萄球菌等引起的继发性细菌性肺炎,其中又以肺炎链球菌为首。目前针对流感继发细菌性肺炎尚无有效的疫苗,其机制不甚明确。本研究中,我们建立流感/肺炎链球菌(IAV/Sp)小鼠共感染模型,发现以肺炎链球菌活菌为免疫原进行免疫可以对单纯Sp以及致死性IAV/Sp共感染具有不同程度的保护作用。我们着重探讨记忆性T细胞在感染过程中的细胞免疫应答,及其与肺炎链球菌活菌免疫发挥的保护机制高度相关。以此为理论基础,研究如何以Sp特异性记忆性T细胞为潜在治疗靶点,调节其在IAV/Sp共感染病理过程中免疫功能和应答,将成为预防和治疗致死性IAV/Sp共感染的可能手段。方法:利用甲型流感病毒PR8(第0天)与肺炎链球菌(TIGR4或P1121)(第5天)鼻腔内感染小鼠建立IAV/Sp共感染模型。感染前30天以TIGR4活菌免疫小鼠,分别再给予不同组小鼠Sp或IAV/Sp感染。通过比较两种感染模型中,细菌特异性记忆性T细胞CD4,CD8细胞比例,CD44活化标记表达、细胞因子分泌等方面,研究记忆性T细胞免疫应答同疾病进展的关系。过继性转移来自Sp免疫小鼠的血清抗体或T细胞,我们观察受体小鼠体重及存活率变化;Luminex检测小鼠肺泡灌洗液细胞因子水平;细菌培养检测肺部细菌量;RT-qPCR检测肺部病毒载量。更进一步,我们利用重组Sp菌株(插入LLO190表位)建立感染模型,检测Sp特异性记忆性CD4 T细胞在感染过程中的免疫应答,研究其对免疫保护IAV/Sp共感染所发挥的作用。结果:本研究中,我们成功建立C57BL/6小鼠致死性单纯Sp感染及IAV/Sp共感染模型。我们发现:1)以Sp活菌免疫小鼠>30天后,对小鼠单纯Sp感染具有完全保护作用,对致死性IAV/Sp共感染具有部分保护作用。2)过继性转移实验结果显示,Sp活菌免疫后所生成特异性抗体及记忆性T细胞分别对单纯Sp感染发挥保护作用,而在IAV/Sp共感染模型中,仅转入记忆性T细胞而非Sp特异性抗体的受体小鼠得到保护。3)以Sp活菌免疫小鼠,比较单纯Sp感染或IAV/Sp共感染后T细胞免疫应答存在明显差异。单纯Sp感染小鼠恢复后,肺内记忆性CD4 T细胞明显增殖活化,IL-17分泌显著上升。IAV/Sp共感染小鼠恢复后,肺内记忆性CD4与CD8 T细胞均明显增殖活化,记忆性CD4 T细胞IL-17分泌明显抑制,转为以IFN-γ分泌为主,同时记忆性CD8 T细胞也分泌大量IFN-γ。4)构建重组Sp菌(该Sp菌PspA抗原基因插入LLO190表位),该表位为李斯特菌所包含的CD4 T细胞特异性表达。因此我们以李斯特菌免疫小鼠>30天后,以该重组Sp菌感染小鼠,通过流式细胞仪检测到免疫小鼠记忆性CD4 T细胞对抗原特异性应答明显增强,提示该重组Sp菌可作为检测Sp特异性记忆性T细胞免疫应答的工具。5)以该重组Sp菌免疫小鼠>30天后,使小鼠IAV/重组Sp共感染,也发现小鼠得到保护;通过流式细胞仪检测到免疫小鼠记忆性CD4 T细胞对抗原特异性应答明显增强,提示Sp免疫对致死性IAV/Sp共感染发挥的保护作用中,抗原特异性记忆性CD4 T细胞起到关键作用。结论:以Sp活菌免疫,分别对小鼠致死性单纯Sp感染或IAV/Sp共感染具有不同程度的保护作用,其中记忆性T细胞发挥主要作用,尤其以Sp特异性记忆性CD4 T细胞免疫应答增强为特点。本研究首次发现记忆性T细胞对致死性IAV/Sp共感染的预防保护具有重要意义,阐明了单纯Sp感染及IAV/Sp共感染中T细胞不同的免疫应答格局,从而为病毒继发细菌性感染的疫苗研发提供理论基础与实验依据。