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褐藻胶是一种来源丰富、用途广泛的酸性海洋多糖，由α-L-古罗糖醛酸(G)及β-D-甘露糖醛酸(M)随机组合形成的线性高分子量聚合物。褐藻多糖及其降解产物褐藻低聚糖已广泛应用于制药、食品、化工等多个领域。研究证明褐藻寡糖在抗肿瘤、抗艾滋病、抗老年痴呆等方面有显著作用，具有广阔的发展前景。褐藻胶裂解酶是通过β消去机制降解褐藻胶，它不但作为工具酶用于褐藻寡糖的制备，而且本身具有一定的药用价值，褐藻胶裂解酶可降解胞外褐藻多糖生物膜恢复病原菌对抗生素的敏感性，在治疗囊性纤维化(CF)患者肺部感染时效果明显。另外，褐藻胶裂解酶还用于藻类原生质体的制备，对藻类生理生化特征等基础研究具有重要作用。然而，由于褐藻胶裂解酶的分离纯化困难以及已发现的酶活性低等原因，导致迄今为止没有一种酶产业化。因此，寻找高活力的新褐藻胶裂解酶具有重要的理论意义和明确的应用前景。 本论文使用选择性培养基广泛地筛选高产褐藻胶裂解酶的菌株，已发现50余株产酶菌株，其中菌株QY101同其它菌株相比，具有酶活高、降解速率快等特点，我们以它作为研究对象进行了本课题的研究工作。 首先对菌株QY101进行了鉴定。菌种鉴定采用形态观察和生理生化反应以及16s rRNA技术，实验结果表明菌株QY101可以鉴定为弧菌属Vibrio，命名为Vibrio.sp.QY 101。 其次，我们进行了Vibrio.sp.QY 101胞外褐藻胶裂解酶的分离纯化。叮brz’o.sp.QY 101以褐藻胶培养基25℃发酵培养，使用80%硫酸按沉淀发酵液上清中的蛋白质，得到粗酶液;将粗酶液上样于以20Inlnol/L pH7.5磷酸盐缓冲液平衡的DEAE一sePharose Fast Flow柱，进行离子交换层析，以8.0 g/L、18.0叭、以及58.0叭Nacl浓度梯度洗脱，分部收集洗脱组分，紫外吸收法检测酶活，发现酶活集中在18.0叭梯度处，大量收集活性组分;DEAE一sepharoseFast Flow纯化得到的活性组分上样于用2伪皿01/L PH7.5磷酸盐缓冲液平衡的sul姆rdex 75 HR凝胶过滤柱，收集活性组分。sDs一PAGE电泳结果表明，得到的褐藻胶裂解酶已达到电泳纯，分子量为39kD;酶反应最适PH为7.5，最适反应温度为30℃:Na‘、Caz+、Mn卜对酶活性有促进作用，FeZ’、Ni”以及EDTA对酶活性有抑制作用。酶的底物专一性分析结果表明，该酶同时具有降解多聚古罗糖醛酸poly(G)及多聚甘露糖醛酸poly(M)的活性。进一步的研究表明，该酶对于细菌所产的乙酞化褐藻胶同样具有降解作用，这一特性为迄今已发现的酶所不具有的。因此，该酶在降解细菌生物膜多糖、恢复其对抗生素的敏感性方面具有良好的应用前景。 在分离纯化过程中，我们发现除了目的收集组分外，尚有一个小的组分有活性，但由于含量低，难以分离纯化。在这种情况下，我们针对该组分更易降解poly(G)的特性，根据已知的褐藻胶裂解酶基因的同源性设计引物，使用简并PCR与反向PCR技术从叮厉z’o.印.QY 101中克隆到一个褐藻胶裂解酶基因二厅yIo基因序列分析发现a1少yI由编码338个氨基酸的IO14bP的开放阅读框组成，其编码的蛋白分子量为38.4 kDa，其中包括分子量大约为4.4 kDa的一段信号肤。利用pET24a(+)建立了a厅叮的高效表达载体，并使用Ni”亲和柱分离得到AlyVI。酶学性质研究表明:Alyv工分子量约为34 kDa，在lmM ZnC12存在的情况下，AlyVI的酶活最适温度为40℃，最适PH为7.5。序列分析表明，AlyVI含有“YXRSELREM”，这9个氨基酸的保守序列仅仅存在于poly(G)活性的褐藻胶裂解酶中。本实验中得到的Al yVI同时具有poly (G)与poly(M)的活性，但是AlyVI对poly(G)的km比对poly(M)的km低一个数量级，说明这个保守序列可能与底物特异性有关。分子量与酶学性质表明AlyVI与层析技术分离纯化得到的褐藻胶裂解酶为两种不同的酶。 综上所述，本论文克服了褐藻胶裂解酶分离纯化过程中酶与底物结合紧密的困难，建立了褐藻胶裂解酶分离纯化的技术平台。利用硫酸按沉淀、离子交换层析及凝胶过滤层析技术从发酵液上清中分离到电泳纯的褐藻胶裂解酶，具有poly(M)与poly(G)的降解活性，同时具有降解细菌产乙酸化褐藻胶的能力，这一特性在国际上属于首次报道。对于这种酶，每升发酵液中可获得IOmg，比活力为163.IU/mg，回收率为47.32%，为大量制备与获得创造了条件。同时，对于无法从天然菌株中分离纯化的另一种酶，使用PcR技术克隆了基因a了少yI，建立了重组酶的高效表达工程菌株和分离纯化技术平台。AlyVI具有更高的活性与产量，比活力为6830U/mg，产量为12mg纯酶/L。以上两种酶的高活性，以及它们在底物特异性上的多样性，很好的说明了叮brz’口.sp.QY101活力高、降解底物褐藻胶快速的现象。因此，这两种新褐藻胶裂解酶的发现，有助于深入探讨褐藻胶裂解酶的分子作用机制，推动了海洋寡糖类创新药物的研究与开发，为耐药细菌生物膜的研究与治疗创造了条件。