研究背景：乳腺癌是目前全球女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在全世界范围内均呈现上升趋势,对女性的健康造成严重威胁。自90年代以来,中国乳腺癌发病率的增长速度已经达到了全球的两倍多,成为中国女性恶性肿瘤发病率的第一位。随着对基因组学、蛋白组学和分子生物学研究的不断深入,人们已经逐步意识到癌症的发生与演变是多种癌基因共同作用的结果,乳腺癌的基因治疗成为研究的热点。基因治疗成功的决定性因素是高效的基因转染和表达,因此目的基因和载体的选择至关重要。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)由间质细胞产生,通过与受体c-Met结合,发生自体磷酸化,促进肿瘤的增殖、侵袭、转移以及血管形成。有文献报道HGF的高表达在乳腺癌的发生、发展和侵袭、转移中发挥了重要作用。NK4首先是作为特异性HGF拮抗剂被发现的,由HGF的N末端氨基酸和4个Kringle区域组成的NK4作为HGF的一部分,能够竞争性拮抗HGF与c-Met结合以及抑制新生血管生成,从而抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭与转移,具有显著的抗肿瘤作用。已有实验证明NK4对胰腺癌、宫颈癌、肝癌等多种恶性肿瘤具有抗肿瘤作用,并在裸鼠动物模型上得到验证。准确地将目的基因导入肿瘤细胞中,载体的选择至关重要。聚酰胺-胺树枝状高聚合物(polyamidoamine dendrimers, PAMAM)是目前应用最广泛的多聚阳离子聚合物之一。其表面的氨基基团(——NH2)可以与DNA主链的磷酸基团产生静电作用,形成稳定的复合物,既提高了目的基因的转运效率,又提高了PAMAM-DNA纳米复合物的稳定性。此外它还具有以下优势：①不会因免疫原性使机体产生免疫反应；②无遗传毒性和细胞毒性；③可以保护目的基因转染后不受机体中血浆、组织细胞中的各种补体以及多种酶的破坏,从而延长其在细胞内的停留和表达时间。目的：选取第5代PAMAM作为基因载体,制备PAMAM-NK4纳米复合物,检测纳米复合物的转染效率并考察其体外对乳腺癌细胞的抑制作用。建立人乳腺癌细胞裸鼠移植瘤模型,观察PAMAM-NK4纳米复合物体内的抗癌效果,为乳腺癌基因治疗的临床研究提供理论基础。方法1. PAMAM-NK4纳米复合物的制备、转染及鉴定1.1人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞株的培养购买的人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞株更换含血清的培养液后,放置在37℃,5% CO2培养箱中常规培养,显微镜下判断细胞状态,定期更换培养液。1.2PAMAM-NK4纳米复合物的制备将提纯后的第5代PAMAM和重组质粒pcDNA3.1-NK4按照5：1的电荷比置于PBS溶液中,震荡混合15s,室温下静置30min。1.3转染人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞株制备浓度为100nmol/L的PAMAM-NK4悬液,分别取2 ml悬液转染对数生长期的MCF-7、MDA-MB-231细胞株,放置在孵箱中常规培养。4h后更换含10%胎牛血清的DMEM培养液,继续培养。1.4体外转染率的检测将转染后的两种细胞株继续培养,24h后置于倒置荧光显微镜下观察,绿色荧光的细胞为转染阳性的细胞,计算转染率。2. PAMAM-NK4纳米复合物对乳腺癌细胞的体外抑制作用2.1 MTT检测PAMAM-NK4纳米复合物转染对乳腺癌细胞增殖的抑制作用将对数生长期的MDA-MB-231、MCF-7细胞株分为对照组、空质粒组(PAMAM组)和实验组(PAMAM-NK4组),每孔加入MTT溶液40μl,4h后去上清。加入150μl DMSO,震荡10 min。测OD值,增殖抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。2.2 Western blot检测PAMAM-NK4纳米复合物转染对乳腺癌细胞NK4蛋白表达的影响取培养至对数期的对照组、空质粒组和实验组细胞,提取各组细胞蛋白,在酶标仪上测蛋白浓度。样品经SDS-PAGE电泳分离总蛋白条带、转膜和封闭后,加入NK4一抗(人HGF单抗)4℃过夜,TBST洗3次,再加入二抗,β-actin为内参。洗膜后显影、扫描胶片、分析条带的灰度值。2.3流式细胞术检测PAMAM-NK4纳米复合物转染对乳腺癌细胞凋亡率的影响分别取对照组、空质粒组和实验组细胞制成细胞悬液,继续培养24h后用胰酶消化、PBS冲洗后加入染色缓冲液重悬细胞。加入荧光标记的Annexin V染料和PI,常温避光孵育15min。加入染色缓冲液,用流式细胞仪分析细胞周期和凋亡率。3. PAMAM-NK4纳米复合物对移植瘤裸鼠模型的抗癌作用的研究3.1构建人乳腺癌细胞移植瘤裸鼠模型制备MDA-MB-231细胞悬液,在裸鼠左侧第二对乳头脂肪垫皮下注射0.2 ml单细胞悬液(约含1×107个细胞),共接种40只裸鼠。接种后,用游标卡尺测量皮下结节的生长情况,记录瘤体长径(a)和短径(b),计算肿瘤体积(V)。计算公式为：V=ab2/2。3.2分组给药并监测PAMAM-NK4纳米复合物对荷瘤鼠肿瘤生长的抑制作用将荷瘤鼠按照完全随机的原则分为4组,每组10只。对照组：肿瘤接种部位旁皮下注射0.2 ml 0.9%氯化钠溶液；空质粒组：肿瘤接种部位旁皮下注射0.2ml溶液,含100μg PAMAM-pcDNA3.1(-)空质粒纳米复合物；实验组：肿瘤接种部位旁皮下注射0.2 ml溶液,含100μg PAMAM-NK4纳米复合物；阳性对照组：腹腔注射0.2 ml多柔比星溶液,含100μg多柔比星。于细胞接种第7d开始,连续给药直至第14 d。隔天测量肿瘤长短径：计算肿瘤体积V=ab2/2。第30d处死荷瘤鼠,完整摘除肿瘤,测量瘤体体积并称重。3.3 Western blot检测PAMAM-NK4纳米复合物对移植瘤组织NK4蛋白表达的影响取各组移植瘤组织,每组各取0.2g,剪碎、磨匀、离心后获得细胞蛋白,测细胞蛋白浓度。经电泳、转膜、封闭,再加入一抗、二抗孵育,分别检测四组移植瘤组织NK4蛋白的表达情况。统计学处理实验数据均采用SPSS 19.0统计学软件进行分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示。组间比较如果方差齐,采用One-Way ANOVA方差分析进行多组间比较,再用LSD进行两两比较；如果方差不齐,采用Welch法进行多组间比较,再用Dunnet’s T3法进行两两比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。结果1. PAMAM-NK4纳米复合物成功转染人乳腺癌细胞株PAMAM-NK4纳米复合物转染乳腺癌细胞株后,在倒置荧光显微镜下可以观察到MDA-MB-231、MCF-7细胞内均有绿色荧光蛋白的表达,MDA-MB-231细胞蛋白表达量更高。自转染后24h开始出现绿色荧光,之后渐渐增多,于48h达到顶峰,72h后荧光强度逐渐减弱。2. PAMAM-NK4纳米复合物对人乳腺癌细胞增殖能力的抑制作用MTT检测结果提示,空质粒组和对照组细胞相比增殖能力无显著性差异。与对照组相比,实验组MDA-MB-231 [(0.27±0.06) vs (0.54±0.06)]、 MCF-7[(0.30±0.05) vs (0.43±0.05)]细胞OD值均显著下降,差异有统计学意义(均P<0.05)。两种细胞株进行对比,MDA-MB-231细胞的抑制率为50.4%,明显高于MCF-7细胞(30.6%),差异具有统计学意义(P=0.01)。3. PAMAM-NK4纳米复合物转染对人乳腺癌细胞中NK4蛋白表达的影响Western blot检测结果提示,对照组MDA-MB-231、MCF-7细胞均有少量HGF表达(即内源性NK4蛋白),表达的平均值分别为：(0.88±0.03)和(0.35±0.01)。转染后空质粒组和对照组相比无明显差异(P>0.05)。实验组两株细胞NK4蛋白表达的平均值分别为：(2.26±0.02)和(1.26±0.01)。实验组与对照组相比两株细胞NK4蛋白的表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.05),且MDA-MB-231细胞中NK4蛋白表达水平更高。4. PAMAM-NK4纳米复合物转染提高人乳腺癌细胞凋亡率空质粒组和对照组相比差异无显著差异(P>0.05)。实验组和对照组相比,细胞凋亡率百分比的差异如下：MDA-MB-231细胞[(2.9±0.04)%vs(2.26±0.06)%]、MCF-7细胞[(2.9±0.06)% vs(2.40±0.04)%],实验组凋亡率明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。5. PAMAM-NK4纳米复合物抑制荷瘤鼠肿瘤的生长接种1周后,接种处肉眼均可见皮下结节,肿物生长缓慢,接种处皮肤无红肿、破溃。成瘤率为100%,各组裸鼠的一般情况可,生活习性无明显改变。第30d完整摘除肿瘤,对照组、空质粒组、实验组和阳性对照组肿瘤体积分别为(2.42±0.62)cm3、(2.38±0.64)cm3、(1.5±0.43)cm3和(1.64±0.31)cm3；肿瘤质量分别为：(3.86±1.12)g、(3.48±1.07)g、(1.41±0.47)g和(1.56±0.38)g。肿瘤体积和质量在对照组和空质粒组之间无显著性差异(P>0.05),实验组和阳性对照组肿瘤体积及质量明显低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),可见肿瘤生长被显著抑制。实验组和阳性对照组相比,无显著性差异(P>0.05)。6. PAMAM-NK4纳米复合物转染对移植瘤组织NK4蛋白表达的影响对照组和空质粒组蛋白表达均有少量内源性NK4蛋白。对照组NK4蛋白表达平均值为(0.8±0.05)；空质粒组和阳性对照组和对照组比较,蛋白的表达量无显著差异(P>0.05)。而转染PAMAM-NK4纳米复合物的实验组NK4蛋白表达平均值为(3.44+0.07),与对照组比较蛋白表达量大幅度升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1. PAMAM-NK4纳米复合物能够成功转染两种乳腺癌细胞,表达NK4蛋白,抑制乳腺癌细胞增殖、促进细胞凋亡,发挥抗癌作用。其中纳米复合物对MDA-MB-231细胞株的转染效率更高、抑制作用更强。2.通过皮下注射乳腺癌MDA-MB-231细胞悬液的方法成功制备移植型乳腺癌裸鼠模型,成瘤率100%。PAMAM-NK4纳米复合物转染后能够在肿瘤组织中成功表达NK4蛋白,显著抑制肿瘤的生长。纳米复合物和化疗药物多柔比星均显著抑制肿瘤生长,两者抑瘤效果无显著性差异。