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黄酮类化合物是一类广泛存在于植物中的次生代谢产物,对于植物的自身防御和生理调节具有重要的作用。黄酮类化合物还具有抗氧化、抑菌消炎、抑制肿瘤细胞活性、抗HIV活性等功能,且毒性较小,药用价值较高。种子植物中黄酮代谢途径已研究的较为透彻,作为黄酮含量较高的蕨类植物,其黄酮代谢途径尚不清楚。查尔酮异构酶(CHI)是黄酮代谢途径的关键限速酶之一,其主要功能为催化柚皮素查尔酮转化为柚皮素,生成的柚皮素是后续多条代谢通路的前体物质,种子植物中的CHI基因属于查尔酮异构酶基因家族,分为TypeΙ、TypeⅡ、TypeⅢ、TypeⅣ四个类型,具有不同的生物学功能。然而,蕨类植物中CHI基因的结构特征、类型及其功能尚不清楚,研究蕨类植物中CHI基因,对阐明黄酮代谢途径的分子机制,揭示CHI基因的功能及其演化均具有重要的科学意义。本研究以红盖鳞毛蕨为实验材料,应用转录组测序、PCR及高效液相色谱技术对查尔酮异构酶基因(CHI)进行克隆及表达分析,并对该基因序列的结构及蛋白结构和蛋白功能等方面做了生物信息学分析。本研究的实验结果主要有以下几个方面:1.利用Ilumina Hiseq 2000平台对红盖鳞毛蕨拳卷叶进行测序,获得8.5G数据量。对获得的数据进行组装拼接,共获得Unigene 143604条。依据注释结果分析获得CHI可能性基因6条,经分析选取其中3条作为CHI的候选基因。2.利用转录组测序技术,成功克隆到三条基因的ORF序列,将三条基因序列重新命名为:DeCHI1、DeCHI2和DeCHI3。生物信息学分析表明,DeCHI1的ORF全长651bp,编码216个氨基酸;DeCHI2的ORF全长822bp,编码273个氨基酸;DeCHI3的ORF全长738bp,编码245个氨基酸。聚类分析表明,DeCHI1与TypeΙ和TypeⅡ呈并列关系;DeCHI2属于Type IV型;DeCHI3属于Type III型。3.本研究成功构建3条CHI的重组质粒pET32a-DeCHI1、pET32a-DeCHI2、pET32a-DeCHI3,将重组质粒导入到BL21感受态细胞中构建原核表达载体,并用IPTG诱导获得融合蛋白,经SDS-PAGE鉴定获得蛋白大小分别为39.7kDa、45.0kDa、43.1kDa,与预期的蛋白大小相一致。4.本研究以柚皮素查尔酮和异甘草素为底物,分别采用3条基因纯化后的融合蛋白对底物进行催化,催化产物上高效液相色谱(HPLC)检测,检测结果表明:(1)DeCHI1、DeCHI2和DeCHI3的蛋白酶均能催化柚皮素查尔酮转化为柚皮素,同时也能催化异甘草素转化为甘草素,与目前报道的种子植物Type III CHI和Type IV CHI蛋白酶没有催化活性不同;(2)DeCHI1不仅能催化柚皮素查尔酮,还能催化异甘草素转化为甘草素,与现有报道仅豆科植物TypeⅡ可催化异甘草素的结论不同,进化树聚类分析结果显示DeCHI1与种子植物的TypeⅠ和TypeⅡ在同一簇中,推测其具有TypeⅠ和TypeⅡ的功能,推测结果与实验结果相符;(3)在DeCHI1、DeCHI2和DeCHI3的蛋白酶催化柚皮素查尔酮转化为柚皮素的过程中推测可能有中间产物产生,产物的具体成分有待进一步研究。综上所述,红盖鳞毛蕨具有不同类型的CHI基因,但其功能尚未产生明显的分化,它们产生的酶均能够催化柚皮素查尔酮转化为柚皮素,同时也能催化异甘草素转化为甘草素,这反映了蕨类植物黄酮类次生代谢途径较为原始的特点。