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酸碱平衡是维持机体内环境稳态的重要环节,正常情况下,外周血和各器官组织的pH约为7.2-7.4。某些病理状态(如炎症、肿瘤和自身免疫病)下,病灶部位酸化(pH下降)是参与相关疾病发生、发展的重要因素。因此,探讨酸化对机体免疫系统(主要是各类免疫细胞)功能的影响,具有重要意义。抗原提呈细胞(APC)重要的免疫系统组分,在固有免疫和适应性免疫应答中发挥重要作用。树突状细胞(DC)是体内最重要的的专职APC,负责摄取、加工和处理抗原,并将抗原信息提呈给初始T细胞,启动抗原特异性T细胞应答。已证明,DC表面多种膜分子参与抗原提呈过程：DC表面MHC分子与抗原肽结合为复合物(pMHC),将抗原肽提呈给T细胞(产生第一信号)；DC表面CD80或CD86与T细胞表面CD28结合,可提供T细胞激活的第二信号(共刺激信号)。此外,DC也参与多种免疫病理过程(如炎症、肿瘤和自身免疫病等)发生、发展。文献已报道,细胞微环境酸化可促进DC吞噬功能和抗原提呈(MHCⅠ类分子途径),但其确切机制尚不清楚。酸敏感离子通道(ASICs, acid-sensing ion channels)是一类H+门控的阳离子通道,属上皮钠通道／退化蛋白[ENaC (epithelial sodium channel)/DEG (degenerin)]家族。ASICs主要表达于中枢和外周神经元,与触觉、学习记忆、痛觉和酸味觉形成有关。近年报道,非神经细胞(平滑肌细胞和骨细胞)和淋巴细胞(T细胞)也可表达ASICs,后者参与相关细胞的功能调控。本研究以小鼠骨髓来源的DC为研究对象,拟探讨重要的专职APC-DC是否表达ASICs,在此基础上,观察微环境酸化对DC的功能调控作用及其与ASICs的关系。一、DC表达功能性ASICs1.DC表达ASICs体外诱导BMDC分化,提取其总RNA和全蛋白,借助RT-PCR和Western blot证明：DC可表达ASIC1、ASIC2和ASIC3的mRNA和蛋白质。借助免疫荧光双标法和免疫电镜胶体金法检测ASIC在DC内的定位,结果显示：ASIC1和ASIC3分别表达于DC内质网和线粒体,细胞膜未见表达；而ASIC2主要表达于胞膜。2.DC表面ASICs的电生理功能借助全细胞膜片钳检测DC所表达ASICs的电生理功能,结果显示：细胞外pH6.0可激活DC胞膜表面ASICs样内向电流,该电流包含早期快速激活和晚期慢速失活两个时相,且能被ASICs阻断剂阿米洛利可逆性阻断(n=6,p<0.05)。pH6.0激活的ASICs样电流具有如下特点：平均幅度为329.63±52.36 pA；该内向电流具有pH依赖性：激活电流的最大pH值在7.0左右,产生最大电流的pH值为5.0；pH50为6.08±0.05,Hill系数为1.03±0.07(n=6)。二、细胞外酸化诱发的DC内向电流依赖于ASICs1.细胞外酸化诱发的DC内向电流不依赖于TRPV1瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1, transient receptor potential vanilloid-1)亦称VR1,属非选择性阳离子通道。细胞外pH值低于6.0,可在细胞膜产生内向电流。以皮层神经元为阳性对照,TRPV1激动剂辣椒素不能诱发DC产生TRPV1电流,提示DC不表达功能性TRPV1。另外,借助RT-PCR也未能在DC检出TRPV1 mRNA表达。上述实验结果提示：细胞外pH值降低诱发DC所产生的电流并非TRPV1介导,其为ASICs依赖性(见前述)。2.非甾体抗炎药抑制DC表面ASICs的电生理功能文献报道,非甾体抗炎药可抑制海马和感觉神经元ASICs的功能。本研究借助全细胞膜片钳技术,观察非甾体抗炎药(布洛芬和双氯芬酸)对DC表面ASICs电生理功能的影响。结果显示：布洛芬(200μM)和双氯芬酸(200μM)均可明显降低DC的ASICs电流(前者从364.17±57.15 pA降低为176.07±28.77 pA,抑制率51.49±3.75%；后者从353.97±51.58 pA降低为166.7±18.57 pA,抑制率51.67±8.3%),该抑制效应为可逆性。上述结果提示,非甾体抗炎药可抑制DC表面ASICs的电生理功能。三、细胞外酸化通过ASICs调控DC功能1.细胞外酸化通过ASICs上调DC表面抗原提呈相关分子表达用ASICs阻断剂阿米洛利(100μM)预处理培养7天的DC(30 min,37℃,5%CO2),然后在pH6.5的培养基中培养4 h(37℃,7%CO2),流式细胞术检测DC表面CD11c、MHCIⅡ、CD80和CD86表达。结果显示：与对照组(pH6.5单独刺激4 h)相比,阿米洛利可明显抑制DC表面相关分子表达(n=6,p<0.05),提示微环境酸化可通过ASICs而调控DC表面抗原提呈相关分子表达。2.非甾体抗炎药通过抑制ASICs功能而影响细胞外酸化对DC表面抗原提呈相关分子表达的调控作用前面实验结果已证实,非甾体抗炎药可抑制DC表面ASICs的电生理功能,提示其如同阿米洛利,具有ASICs阻断剂的效应。据此,本实验应用非甾体抗炎药探讨细胞外酸化对DC表面抗原提呈相关分子表达的调控作用与ASICs的关系。培养7天的DC用非甾体抗炎药布洛芬或双氯芬酸(均为200μM)预处理30 min(37℃,5%CO2),然后在pH6.5培养基培养4h(37℃,7%CO2),流式细胞术检测表面分子CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86表达。结果显示：与对照组(pH6.5单独刺激4h)相比,布洛芬和双氯芬酸处理组的分子表达水平明显降低(n=6,p<0.05),提示细胞外酸化对DC表面抗原提呈相关分子表达的调控作用为ASICs依赖性。结论1. BMDC可表达功能性ASICs,后者参与细胞外酸化对DC表面抗原提呈相关分子表达的调控作用。2.非甾体抗炎药可调控DC表面ASICs的电生理功能,并影响微环境酸化对DC表面抗原提呈相关分子表达的调节作用,提示ASICs可能是非甾体抗炎药发挥免疫抑制效应的新靶点。