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为观察甲状旁腺素相关肽(Parathyroid hormone related protein,PTHrP)及其受体在脊髓与少突胶质细胞(Oligodendrocytes,OLs)中的表达,我们采用免疫组化染色检测PTHrP及其受体在脊髓的表达。结果显示PTHrP及其受体在3、7和14天龄C57B1/6小鼠脊髓均有表达,且PTHrP在白质区表达强于灰质区。经髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein,MBP)与PTHrP免疫荧光双标显示在14天龄小鼠成熟的少突胶质细胞上也有PTHrP表达;通过免疫磁珠分选法(magnetic activated cell sorting,MACS)分选3天龄C57B1/6小鼠大脑皮层04阳性的少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte progenitor cells,OPCs),体外增殖培养7天后行PTHrP免疫荧光染色。结果显示PTHrP在O4阳性的OPCs有强表达。上述结果提示PTHrP在少突胶质细胞发育中可能发挥重要作用。为了研究 PTHrP 核定位序列(Nuclear localization sequence,NLS)和 C-末端缺失对OLs发育的影响,我们采用PTHrP Knock-In(KI)小鼠,简称KI小鼠(通过在小鼠PTHrP基因第84位氨基酸序列后敲入(Knock-In)氨基酸翻译的终止密码子TGA,建立的一个只表达PTHrPl-84而不表达NLS和C-末端的小鼠模型),通过组织学、细胞和分子生物学等方法,结合体内外实验比较分析了出生后7天与14天(P7和P14)野生型(wild-type,WT)和KI小鼠OLs的表型差异。首先,我们采用在体研究,观察PTHrP KI小鼠少突胶质细胞发育的变化。少突胶质前体细胞标志物Olig2和成熟少突胶质细胞标志物MBP免疫荧光染色结果显示:与WT小鼠相比,P7和P14 KI小鼠脑与颈髓中Olig2或MBP阳性细胞百分率均明显降低。Real-time RT-PCR结果显示P7和P14 KI小鼠脑和脊髓中Olig2、CNPase和MBP mRNA表达水平明显下调。Western-blot结果显示P7和P14KI小鼠脊髓中PDGFRα和Olig2蛋白表达水平下调。上述结果说明PTHrP NLS和C-末端缺失造成小鼠脑与脊髓中少突胶质细胞发育延迟。为了明确PTHrP NLS和C-末端缺失导致小鼠CNS中OLs发育延迟是否与细胞增殖降低有关,我们利用BrdU在体掺入、BrdU/Olig2免疫荧光双标染色方法比较分析PTHrP KI小鼠与同窝WT小鼠具有增殖能力的OPCs数目的差异。结果显示:P7和P14 KI小鼠颈髓腹外侧区和小脑中BrdU/Olig2双阳性细胞百分率均较WT小鼠降低,P7 KI小鼠大脑海马区BrdU/Olig2双阳性细胞百分率较WT小鼠降低。这些结果说明PTHrP NLS和C-末端缺失导致少突胶质细胞发育延迟与少突胶质前体细胞的增殖降低有关。上述在体研究结果显示PTHrP KI小鼠CNS中少突胶质细胞发育延迟,可能原因或是PTHrPNLS和C-末端缺失对OLs的直接作用,或由于PTHrP KI引起小鼠CNS内环境的变化而间接导致。为进一步明确PTHrP NLS和C-末端缺失对OLs发育的直接作用及机制,我们利用O4阳性免疫磁珠分选法分选P3 WT和KI小鼠大脑皮质中OPCs,行体外培养,观察OPC增殖、凋亡、分化,细胞周期相关指标及细胞氧化应激相关指标的变化。首先,我们采用WT和KI小鼠来源的OPCs行体外增殖培养后再分化培养3天,经固定后,利用CNPase、APC(不成熟少突胶质细胞标志)和MBP细胞免疫荧光染色观察PTHrP NLS和C末端缺失对体外培养的OPCs分化成熟的直接影响。结果显示:分化培养3天后,与WT小鼠来源的OPCs相比,KI小鼠来源的OPCs的CNPase和APC阳性细胞数目均减少,胞浆染色淡,突起减少,未见MBP阳性细胞。这些结果表明在体外PTHrP NLS和C-末端缺失可直接导致少突胶质细胞分化及成熟障碍。其次,我们收集原代培养9天后的OPCs及分化培养7天后细胞的mRNA与蛋白,利用Real-time RT-PCR检测OPCs及OLs的标记物Olig2、CNPase和MBP的表达;细胞抗凋亡指标Bcl2,细胞增殖指标Bmil的表达；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p19、p21、p27、p53,细胞周期蛋白依赖性激酶CDK2,细胞周期蛋白Cyclin E的mRNA表达;细胞抗氧化指标超氧化物歧化酶SOD1、谷胱甘肽过氧化物酶GPX1、过氧化氢酶CAT的表达。利用Western blot检测原代培养9天后的WT和KI小鼠来源的OPCs中OPCs标记蛋白PDGFRα、Olig2和Rip(不成熟少突胶质细胞标志物);凋亡指标Caspase3,增殖指标Bmil和PCNA;细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p16的蛋白表达水平。结果显示:与WT小鼠来源的原代OPCs相比,KI小鼠来源的原代OPCs的标记物Olig2、CNPase mRNA表达水平下调,PDGFRα、Olig2和Rip蛋白表达水平也下调;增殖相关Bmil和Bc12 mRNA表达水平下调,Bmi1和PCNA蛋白表达水平也下调,而凋亡相关Caspase3蛋白表达水平上调;p19、p21、p27、p53 mRNA表达水平明显上调,CDK2和CyclinEmRNA表达水平均明显下调,而p16蛋白表达水平上调;抗氧化酶SOD1、GPX1、CAT mRNA表达水平下调。分化培养7天后,KI小鼠来源的OPCs的Olig2、CNPase、MBP mRNA表达水平显著下调;Bc12和Bmil mRNA表达水平下调;p19、p21、p27、p53mRNA表达水平均明显上调,CDK2 和 CyclinEmRNA 表达水平均明显下调;SOD1、GPX1、CAT mRNA表达水平明显下调。体外培养结果说明PTHrPNLS和C-末端缺失可直接导致少突胶质细胞发育障碍,其机制与PTHrP NLS和C-末端缺失导致OPCs的细胞增殖与分化能力降低,抗氧化能力减弱,而凋亡增加有关。综上所述,本研究结果证明PTHrP NLS和C-末端缺失能够通过上调p16、p19、p21、p27、p53的表达水平,下调CDK2和CyclinE的表达水平,而抑制OPCs增殖,诱导OPCs凋亡,延迟少突胶质细胞发育。同时,PTHrP NLS和C-末端缺失还可通过下调细胞抗氧化酶SOD1、GPX1、CAT的表达,减弱少突胶质细胞的抗氧化能力,激活细胞氧化应激损伤,从而促进凋亡,导致少突胶质细胞发育异常。本研究结果初步阐明了 PTHrP NLS和C-末端在少突胶质细胞发育中的作用和机制,为将PTHrP NLS和C-末端开发为新的治疗CNS脱髓鞘疾病的靶标提供了初步的实验依据。