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研究背景:肝细胞色素氧化酶P450（Cytochrome P450,CYP）是机体药物代谢的重要酶类。其受众多因素影响,其中缺氧系为其中的一个重要因素。实验研究证实慢性或急性持续缺氧（Sustained hypoxia,SH）可影响CYP亚型活性变化,并引起经过其代谢的药物浓度发生变化。而临床研究也发现以SH为特征的疾病,其药物的生物代谢水平也易发生变化,在此类患者中的用药需注意调整相关药物的用药剂量。阻塞睡眠呼吸暂停综合征（Obstructive sleep apnea,OSA）为临床上极为常见的病症,其以反复夜间打鼾伴呼吸暂停,合并白天嗜睡及高血压、心脑血管疾病等并发症为特点。间歇缺氧（Intermittent hypoxia,IH）及睡眠片段化为其重要的病理生理学特征。IH可引起氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、内皮损害,我们既往研究已明确IH可引起肝脏超微结构改变,但IH是否和SH一样,可引起机体肝脏CYP亚型发生变化,并影响相应药物代谢水平,目前极少研究关注。研究目的:本研究通过构建类似OSA为特征的IH小鼠模型,明确IH是否可引起肝脏CYP亚型基因及蛋白变化;通过构建IH体外细胞模型,在细胞水平上予以验证小鼠实验的发现,并检测通过相应CYP亚型代谢的药物浓度变化,通过对不同分子的干预来阐述IH引起肝药酶CYP亚型变化的分子机制。同时建立IH的新西兰兔模型,检测通过相应CYP亚型代谢的药物浓度变化,验证小鼠及细胞水平的发现。通过小鼠、细胞和兔子三个水平,明确IH是否影响肝药酶CYP活性改变及相应药物浓度变化。为以IH为特征的OSA患者是否需要调整相关药物的给药剂量提供基础实验依据。研究方法:1.将24只C57BL/6J雄性小鼠,按随机数字法分为正常氧对照组和IH组,每组12只;将IH组小鼠置入舱内进行IH,实验周期12周。实验结束,将小鼠麻醉后取血处死,取出肝脏;检测两组小鼠血谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平,检测肝脏显微镜下改变。应用实时聚合酶链反应（Real time-polymerase chain reaction,RT-PCR）法检测肝组织CYP不同亚型（Abcb1a、CYP1A2、CYP2A5、CYP2C29、CYP2E1、CYP3A11和CYP3A25）的mRNA变化。应用蛋白免疫印迹法（Western blot,WB）检测小鼠肝组织匀浆和微粒体CYP1A2的蛋白表达水平。WB检测NF-κB蛋白的表达。应用免疫组化法（Immunohistochemistry,IHC）检测肝组织CYP1A2蛋白表达水平。2.（1）构建LO-2肝细胞的IH模型,将细胞分为正常氧对照组和IH组,收集实验前、实验24h和48h两组细胞或上清液进行检测。检测不同时间段IH组和正常氧对照组肝细胞细胞活力;应用流式细胞学检测两组细胞不同时间段的凋亡水平;应用RT-PCR法检测CYP1A2 mRNA表达情况。用蛋白免疫印迹和流式细胞法检测两组CYP1A2蛋白表达水平差异。（2）在正常氧对照组和IH组上清液中加入适当浓度的氨茶碱和华法林,在共同培养24h和48h后,收集两组上清液,应用高效液相色谱（High-performance liquid chromatography,HPLC）法检测两组细胞培养上清液中的以上药物浓度并进行比较。3.（1）将细胞分为IH组和正常氧对照组,每组细胞分别加入以下干扰措施:HIF-1α抑制剂（YC-1）、NF-κB抑制剂（SC75741）、AhR配体（NOR）和AhR抑制剂（SR1）;依据是否IH和不同干扰措施,细胞再细分为13组分别进行处理,实验周期48h。而后将收集以上13组细胞,分别针对以上分子及CYP1A2进行RT-PCR检测mRNA、WB检测蛋白水平,验证各干预措施效果。（2）依（1）中WB检测结果,设置了正常氧对照组、IH组、IH+YC-1+NOR组、IH+SC75741+NOR组,上清液中加入氨茶碱,用HPLC法检测不同组别氨茶碱浓度的差异。（3）将细胞分为IH组和正常氧对照组,分别加入YC-1、SC75741、NOR和SR1,设计出7组不同干预组别,并用染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）检测不同组别转录因子AhR与CYP1A2基因启动子结合、富集的程度,以验证IH是否通过AhR转录因子影响CYP1A2基因表达,并了解IH下不同干预措施AhR与CYP1A2基因启动子结合程度变化。4.将20只新西兰兔按随机数字法分为正常氧对照组和IH组,每组10只,各组内再分为氨茶碱组（5只）和华法林组（5只）。除间歇缺氧时段外,两组兔子生活和饲养条件一致,实验周期5周。在实验最后一周,通过静脉注射或口服给予氨茶碱和华法林,并在不同时段予抽取静脉血,应用HPLC法检测两组上述药物的血药浓度,实验结束,杀死兔子,取出肝脏,应用WB和IHC法检测两组CYP1A2蛋白表达情况。研究结果1.通过12周的IH,发现IH组和正常氧对照组小鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶数值无统计学差异（p>0.05）,两组肝显微镜下结构变化也无明显差异。应用RT-PCR法筛查小鼠肝脏CYP各亚型mRNA的表达,发现CYP亚型中Abcb1a、CYP2A5、CYP2C29、CYP2E1、CYP3A11和CYP3A25的表达在IH和正常氧对照组中无差异（p>0.05）,而CYP1A2 mRNA表达在IH组明显低于正常氧对照组（p<0.05）。而WB检测发现小鼠经IH 12周后,其肝匀浆和微粒体CYP1A2蛋白表达水平明显下降（all p<0.05）;且发现IH可促进NF-κB的表达增高（p<0.01）。IHC法同样发现IH可引起小鼠肝组织CYP1A2表达水平下降（p<0.05）。2.（1）在24h后肝细胞活力在IH组和正常氧对照组无差异;而在48h后,与同时间段正常氧对照组相比,肝细胞活力明显下降;流式细胞学检测发现IH组48h后,其肝细胞凋亡水平升高（p<0.05）;RT-PCR结果显示CYP1A2 mRNA表达下降;WB和流式细胞学检测同时也提示IH 48小时后,与正常氧对照组相比,IH组肝CYP1A2蛋白表达水平下降（all p<0.05）。（2）HPLC法检测结果显示在药物与肝细胞培养24h后,IH组和正常氧对照组细胞培养上清液中的氨茶碱和华法林水平无明显差异（all p>0.05）;而在培养48h后,IH组氨茶碱浓度高于正常氧对照组（p<0.05）,而两组之间华法林浓度差异不论在试验24h或48h均无明显统计学意义（p>0.05）。3.（1）IH可抑制CYP1A2 mRNA和蛋白表达;与单纯IH组相比,在应用不同干预措施后发现,分别抑制HIF-1α（YC-1）和NF-κB（SC75741）、加用AhR配体（NOR）或相关组合后,CYP1A2 mRNA表达可升高;而在蛋白水平上,WB结果显示只有YC-1+NOR组和SC75741+NOR组在IH下其CYP1A2蛋白表达较单纯IH有回升,差异有达统计学意义（p<0.01）。（2）与正常氧对照组相比,IH组氨茶碱浓度增高（p<0.05）,而在IH+YC-1+NOR组和IH+SC75741+NOR组氨茶碱浓度较IH组下降（p<0.05）,与正常氧对照组无明显差异（p>0.05）。（3）以AhR为抗体的ChIP实验结果显示,不论RT-PCR或琼脂糖电泳,与正常氧对照组相比,单纯IH组CYP1A2基因启动子数量减少,差异有明显统计学意义（p<0.01）;而在IH条件下分别抑制HIF-1α（YC-1）和NF-κB（SC75741）、或加用AhR配体（NOR）或相关组合后,CYP1A2基因启动子表达数量较IH组明显增高（all p<0.05）。4.经过IH 5周后发现,与正常氧对照组相比,WB和IHC法检测均发现IH组新西兰兔肝CYP1A2表达水平下降;而在单剂量给药后,在不同时段检测时发现IH组多时段氨茶碱浓度高于正常氧对照组（p<0.05）;在药物代谢动力学方面,与正常氧对照组相比,IH组的氨茶碱的T1/2明显延长（多于正常氧组1.26小时）（p<0.001）,而AUC0-t和AUC0-∞也明显升高（p<0.001）;但华法林检测则发现,在不同时段,正常氧对照组和IH组血药浓度差异无统计学意义（p>0.05）,各药代动力学参数比较两组间也无明显差异（p>0.05）。研究结论1.小鼠研究发现IH可选择性引起肝药酶CYP1A2 mRNA和蛋白表达水平下降。2.体外正常人肝细胞研究证实IH可引起肝药酶CYP1A2表达下降,而经过CYP1A2代谢的氨茶碱浓度增高。3.分子机制研究发现HIF-1α、NF-κB通过影响转录因子AhR表达参与了IH诱发CYP1A2表达下降的过程。4.IH暴露可引起新西兰兔血氨茶碱（经过CYP1A2代谢）浓度增高,半衰期延长。