毕赤酵母表达重组人胰激肽原酶

来源 :北京化工大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:huishouzhong2
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胰激肽原酶(pancreatic kallikrein,PK)作用于低分子量的激肽原释放出赖氨酰缓激肽 (又名胰激肽原)。激肽原酶和激肽系统(KKS)是维持血压平衡的一个重要组成部分,对血压、电解质平衡、炎症反应等生理或病理过程进行调控。因此,胰激肽原酶具有广泛的药用价值,除降血压之外,还可以用于治疗糖尿病肾病、改善肾脏功能,治疗心、脑血管疾病等。本文利用嗜甲醇毕赤酵母(Pichia pastoris)表达重组人胰激肽原酶(human pancreatic kallikrein,hPK)。首先将hPKcDNA克隆至毕赤酵母穿梭表达质粒pPIC9K构建重组质粒pPIC9K/hPK,经BglII线性化酶切,电穿孔将其整合到毕赤酵母GS115 (His-Mut+)染色体上,利用MM、MD平板筛选His+Muts型阳性克隆,含不同浓度G418-YPD平板筛选高拷贝转化子。共筛选到27株阳性克隆,其中3株是高拷贝。筛选到的高拷贝进行BMGY/BMMY摇瓶培养,诱导表达重组hPK。表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳分析,重组目标蛋白质量分数达总蛋白的30%以上;相对分子质量为37 000,较理论设计值26 500大,由糖基化分析是因目标蛋白发生糖基化所致。 <WP=4>在基础盐培养基中进行摇瓶表达,初步优化了培养条件,在pH6.0、60%的原盐浓度条件下生长较好。透析脱盐后的发酵液经几种离子交换层析柱进行初步的分离纯化,比较发现弱阴离子DEAE Sepharose FF作用效果较好,目标蛋白获得选择性吸附洗脱,分离体系得到浓缩。纯化得重组hPK经Trypsin进行酶原活化后测定酶活,比活达5.6U/mg。动力学参数测定Km值为5.4×10-2mM,与文献值接近,进一步说明重组hPK在毕赤酵母中获得了正确的表达。初步建立了培养、分离重组hPK的工艺,为进一步的研究工作提供了参考。
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