胰激肽原酶（pancreatic kallikrein，PK）作用于低分子量的激肽原释放出赖氨酰缓激肽 (又名胰激肽原)。激肽原酶和激肽系统（KKS）是维持血压平衡的一个重要组成部分，对血压、电解质平衡、炎症反应等生理或病理过程进行调控。因此，胰激肽原酶具有广泛的药用价值，除降血压之外，还可以用于治疗糖尿病肾病、改善肾脏功能，治疗心、脑血管疾病等。本文利用嗜甲醇毕赤酵母（Pichia pastoris）表达重组人胰激肽原酶（human pancreatic kallikrein，hPK）。首先将hPKcDNA克隆至毕赤酵母穿梭表达质粒pPIC9K构建重组质粒pPIC9K/hPK，经BglII线性化酶切，电穿孔将其整合到毕赤酵母GS115 (His-Mut+)染色体上，利用MM、MD平板筛选His+Muts型阳性克隆，含不同浓度G418-YPD平板筛选高拷贝转化子。共筛选到27株阳性克隆，其中3株是高拷贝。筛选到的高拷贝进行BMGY/BMMY摇瓶培养，诱导表达重组hPK。表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳分析，重组目标蛋白质量分数达总蛋白的30％以上；相对分子质量为37 000，较理论设计值26 500大，由糖基化分析是因目标蛋白发生糖基化所致。 <WP=4>在基础盐培养基中进行摇瓶表达，初步优化了培养条件，在pH6.0、60％的原盐浓度条件下生长较好。透析脱盐后的发酵液经几种离子交换层析柱进行初步的分离纯化，比较发现弱阴离子DEAE Sepharose FF作用效果较好，目标蛋白获得选择性吸附洗脱，分离体系得到浓缩。纯化得重组hPK经Trypsin进行酶原活化后测定酶活，比活达5.6U/mg。动力学参数测定Km值为5.4×10-2mM，与文献值接近，进一步说明重组hPK在毕赤酵母中获得了正确的表达。初步建立了培养、分离重组hPK的工艺，为进一步的研究工作提供了参考。