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目的:1.检测乙硫氨酸腹腔注射C57BL/6孕鼠是否可以引起胎鼠神经管畸形（neural tube defects,NTDS）的发生。2.从C57小鼠中提取原代神经干细胞（neural stem cells,NSCs）,并进行培养、鉴定,为研究乙硫氨酸引起神经管畸形的研究提供细胞模型。3.通过研究乙硫氨酸对神经干细胞功能的影响,初步研究乙硫氨酸在其引起的C57BL/6小鼠胚胎神经管畸形发生过程中的作用。方法:1.通过腹腔注射的方式,将乙硫氨酸以100 mg/kg的剂量注入到C57BL/6怀孕第7.5天（E7.5）母鼠体内,然后继续饲养至E9.5、E10.5和E11.5时分别提取分离出完整的胚胎,通过体视显微镜及HE染色的方法观察及检测E10.5和E11.5时胚胎的前脑、后脑的闭合情况,对造模的结果进行验证。2.从孕E13.5天的C57胎鼠脑组织中,通过机械法提取原代NSCs,然后用悬浮细胞培养法进行体外培养;用免疫荧光染色法通过检测NSCs的Nestin特征蛋白来初步鉴定NSCs;然后再次用免疫荧光染色法检测其分化后神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特征蛋白来进行进一步的NSCs分化鉴定。3.将乙硫氨酸加入到神经干细胞的增殖培养基中,将实验分为两组:对照组（正常培养的NSC组）、实验组（加乙硫氨酸培养的NSC组）,两组细胞各培养一段时间,在荧光显微镜下观察其细胞形态并摄片,在Image-J软件下,随机选取每组5-10个不同的视野进行神经球的计数并用GraphPad Prism 5软件分析作图,以此观察其集落形成能力、神经球的形成比例以及细胞的生长状态,初步推断乙硫氨酸对神经干细胞的增殖的影响。4.通过Cell Counting Kit-8法（CCK-8法）检测实验组和对照组的细胞增殖变化情况;5.通过流式细胞术检测实验组和对照组的细胞凋亡的变化情况。6.通过Western blotting蛋白印迹法法检测Caspase 3蛋白表达变化。7.通过流式细胞术检测实验组和对照组的细胞周期的变化情况。8.通过免疫荧光的方法检测实验组和对照组两组分化情况的差异。9.统计学分析方法:数据均用均数±标准差（X±S）表示,统计学分析采用SPSS17.0软件,两个样本均数间差异采用t检验,多个样本均数采用方差分析,*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,当P<0.05时可认为差异具有统计学意义。数据作图使用GraphPad Prism 5软件以及Image-J灰度值分析软件。结果:1.乙硫氨酸腹腔注射怀孕E7.5的C57BL/6孕鼠,成功诱导出小鼠NTDs,最佳致剂量为100 mg/kg,NTDs发生率为54.7%,小鼠NTDs主要表现为颅面畸形和发育迟缓,其它畸形有后脑神经管未闭、前脑发育不足等;HE染色可见神经管畸形胎鼠前后脑泡未闭合,结构异常。2.原代提取的NSCs生长状态良好。Nestin免疫荧光染色呈阳性;NSCs分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特征性蛋白NF-H、MAP2、GFAP和GALC,结果也均呈阳性显色。3.实验组和对照组在集落形成能力和神经球的形成比例上均有差异,最佳添加浓度为10 mmol/L;对照组集落形成能力显著高于实验组,差异具有统计学意义（12.60±1.074 vs.5.50±0.893,t=10.80,P<0.05）。实验组直径小于100μm的神经球的数量虽比对照组的多,但对照组在直径大于100μm的神经球的数量上的远多于实验组,差异具有统计学意义（P<0.05）。4.CCK-8法结果得出:实验组0 h时的吸光度值（OD）与对照组无明显差异,而接下来的1-5天的OD值,实验组则显著低于对照组,差异具有统计学意义（1d:t=7.227,P=0.0019;2d:t=8.855,P=0.0009;3d:t=15.95,P<0.0001;4d:t=31.83,P<0.0001;5d:t=9.017,P=0.0008）。表明乙硫氨酸显著降低了NSCs的增殖能力,差异有统计学意义（P<0.05）。5.流式结果显示:早凋率和晚凋率的变化与时间成正比例关系,随着NSCS体外给予乙硫氨酸干预时间的延长,早凋率和晚凋率都逐渐升高,总凋亡率也随着NSCS体外给予乙硫氨酸干预时间的延长逐渐升高,差异有统计学意义。（总凋亡0 h vs.72h:P=0.0037,总凋亡48 h vs.72 h:P=0.0141,总凋亡0 h vs.48 h:P=0.0084）。6.Western blotting法显示,在Caspase3蛋白表达量上,实验组比对照组高,P<0.01,差异有统计学意义。7.流式结果显示:处于G1期的细胞数,实验组显著高于对照组（P<0.0001）,而处于S和G2期的细胞数,实验组显著低于对照组(PS=0.0002,PG2=0.0021),差异具有统计学意义。实验组的细胞被捕获在了G1期,无法进入S期。8.免疫荧光结果显示:实验组向神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞分化的能力都低于对照组。结论:1.乙硫氨酸腹腔注射可引起C57BL/6胎鼠NTDS,提示叶酸的甲硫氨酸循环代谢障碍与NTDS发育有关,且此模型的建立为后续研究甲硫氨酸循环障碍与NTDS的关系即乙硫氨酸在NTDS中的作用提供了动物模型依据。2.经过一系列的提取、培养、鉴定,成功的为后面的实验提供了可靠的细胞模型。3.通过研究乙硫氨酸对神经干细胞的细胞功能的影响,初步表明乙硫氨酸可能通过引起神经干细胞的增殖减少,凋亡增多及干扰神经干细胞的分化功能在引起C57BL/6小鼠胚胎神经管畸形的发生过程中发挥了一定的作用。