泌盐植物中华补血草SOS1基因的克隆及其功能研究

来源 :烟台大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yuxuan_huang
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盐胁迫是严重影响植物生长发育的非生物因素之一。土壤盐渍化会引起大多数植物体内Na+过量积累,进而影响植物的生长。盐生植物能在盐渍环境下正常生长,因此,克隆盐生植物的耐盐性关键基因并研究其功能,有助于深入理解植物的耐盐机制,利用相关的基因资源,培育转基因耐盐植物,有效地改善和利用盐渍化土地。本实验以泌盐盐生植物中华补血草(Limonium sinense Kuntze)为材料,首先研究了补血草幼苗在不同盐浓度下的胁迫响应、SOS1基因的表达变化及中华补血草叶片中抗氧化酶的活性变化;其次,克隆了中华补血草SOS1基因(LsSOS1),构建了过量表达载体、融合基因表达载体及沉默干扰表达载体,在拟南芥中将LsSOS1基因进行了过量表达和LsSOS1-GFP融合基因的表达并在中华补血草中做了LsSOS1RNAi遗传转化。对获得的纯合转基因拟南芥及LsSOS1沉默转基因中华补血草进行分子鉴定、耐盐性分析、LsSOS1表达产物定位观察及LsSOS1基因的表达变化研究。进一步了解LsSOS1基因在盐生植物中华补血草耐盐过程中的重要作用。实验主要结果如下:(1)中华补血草幼苗在不同盐浓度下的胁迫响应及LsSOS1基因的表达变化弯根实验中,低盐浓度下补血草根的生长情况好于对照,随着盐浓度的升高,根的生长逐渐受到抑制。NaCl浓度高于200mmol/L时,中华补血草受到盐胁迫,LsSOS1基因的表达量升高,根部高于叶片。(2)盐胁迫下中华补血草叶片中抗氧化酶的活性变化中华补血草在低盐处理下,酶促活性氧自由基清除系统的各种酶活性与对照相比没有明显变化。但是,随着NaCl浓度的增加,中华补血草受到盐胁迫,活性氧清除酶类(SOD、POD、APX、CAT)的酶活性上升。说明在一定的浓度范围内,补血草可以通过调节自身的抗氧化酶系统及其独特的泌盐、耐盐机制来抵御盐胁迫带来的损伤,维持正常的生长。(3)中华补血草LsSOS1基因的克隆及序列分析根据其他物种中保守的SOS1基因序列,设计简并引物,利用RACE的方法克隆得到LsSOS1基因序列,开放阅读框包含3456个核苷酸,推导编码的蛋白质有1152个氨基酸残基组成,与大叶补血草SOS1基因(Limonium gmelinii SOS1)的同源性最高,达到了97%,编码一种Na+/H+逆向转运蛋白。(4) LsSOS1基因异源过量表达研究筛选得到了10个过表达LsSOS1的转基因拟南芥株系,选用三个纯合转基因株系进行分子研究和生理生化分析。通过Real-time PCR分析LsSOS1基因在拟南芥中表达量的差异。在不同浓度NaCl胁迫下,转基因植株的萌发和生长情况要优于野生型,转基因植株比野生型植株的耐盐性有所提高,转基因植株的鲜重、干重及K+/Na+比率高于野生型,但是转基因植株间的差异并不明显。(5) LsSOS1表达产物亚细胞定位分析筛选得到过量表达P35S::LsSOS1-GFP的转基因拟南芥。在共聚焦显微镜下通过观察GFP的绿色荧光确定LsSOS1表达产物的定位。初步确定了LsSOS1在细胞膜或细胞壁上表达,而不是在液泡膜或细胞质中。为了进一步确认是在细胞质膜上,可以用甘露醇将细胞皱缩质壁分离,再进行观察。(6) LsSOS1RNAi沉默转基因中华补血草耐逆性分析通过优化遗传转化体系,外植体的转化率达到了20%,筛选获得了30株LsSOS1RNAi沉默转基因株系。对其中的3个株系进行LsSOS1基因的表达研究和生理生化指标的测定。通过Real-time PCR分析发现沉默转基因中华补血草SOS1基因的表达量低于野生型。在NaCl处理下,转基因植株的长势不如野生型,耐盐性降低,转基因植株的鲜重、干重及K+/Na+比率低于野生型。
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