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第一部分,SARS—Cov N基因的表达及功能研究。SARS-CoY是一种具包膜的单股正链RNA病毒,它是冠状病毒家族中新出现的一个种。SARS—Cov核衣壳体蛋白N是SARS-Cov的重要的结构蛋白质之一,是在患者血清中抗体含量最多的蛋白。为了进一步研究N蛋白的功能,我们分别利用原核和真核表达系统表达了重组的N蛋白,并通过Ni2~+柱进行了纯化。用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,得到了效价高、特异性好的多克隆抗血清。 以前研究发现PRRSV、IBV、MHV和TGEV等冠状病毒的N蛋白都定位在细胞质与核仁中,这可能是冠状病毒的共有特征。序列分析发现SARS-Cov N蛋白基因中也有一核定位信号序列(KKDKKK,370-376aa)。我们利用制备的多克隆抗血清,通过杆状病毒表达系统和真核表达系统分别在Tn-581-4和Hela细胞中对N进行了亚细胞定位。通过共聚焦荧光显微镜在细胞质与核仁中都观察到了表达的N重组蛋白,因此,SARS-CoY核衣壳体蛋白的亚细胞定位于细胞质与核仁中,这一现象可能与N蛋白的生物功能有密切联系。 SARS-CoV病毒主要感染肺部组织,通过诱导肺组织细胞凋亡而引起损伤,细胞凋亡可能在SARS发病中起重要的作用。进一步了解SARS-Cov病毒感染与细胞凋亡过程所可能涉及的病毒基因将对了解SARS-CoW的致病机制有重要的意义。定位于细胞核仁的内源蛋白多参与细胞途径的调节,很多病毒通过其病毒基因编码蛋白诱导或者抑制寄主细胞信号传导途径来参与细胞调节。我们利用Hela细胞,进一步研究N蛋白在诱导细胞调亡方面的作用,结果发现重组的N蛋白能够通过capsase途径诱导Hela细胞的调亡。 第二部分,蛇毒去整合素结构域agkistin-s的表达及功能研究。去整合素(disintegrin)是从蛇毒中分离出含有Arg-G1y-Asp(RGD)或Lys-Gly-Asp(KGD)结构域的富含半胱氨酸的一群低分子量多肽。去整合素能够通过其RGD三肽拮抗血管内皮细胞表面的整合素与细胞外基质黏附,并诱发其凋亡,从而抑制血管新生血管的生长。肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的基础,抗血管的生成能够有效