卵巢上皮性癌（简称卵巢癌）占卵巢恶性肿瘤的90%，是生殖道恶性肿瘤中死亡率最高的疾病。目前，大部分卵巢癌患者经过彻底的细胞减灭术和术后含铂类药物的联合化疗后，虽有相当长的完全缓解期，但仍有70%患者在几年或者十几年内复发。这一临床现象可以用肿瘤休眠解释，肿瘤休眠是指宿主免疫与静止残余瘤之间的一种亚临床平衡状态，也可理解为微小的残留病灶，休眠的肿瘤细胞长期存在是恶性肿瘤难以彻底根治的主要原因。越来越多的研究表明，肿瘤休眠与肿瘤干细胞（cancer stemcells, CSCs）密切相关。虽然尚未明确这些具有不同的表型和异质性的CSCs是肿瘤的恶性根源，但是这些具有成体干细胞（adult stem cells,ASCs）特性的CSCs可以解释肿瘤细胞的休眠，比如CSCs同ASCs一样潜伏于壁龛中处于相对静止状态，可以躲避药物的杀伤继续存活而成为肿瘤复发的根源。因此，学者们推测CSCs在某种调节因素作用下发生了休眠—增殖状态的功能转换、重新进入增殖期，从而导致疾病的复发。胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor, IGF）是体内强有力调控生长和代谢的因子，而IGF需要通过胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）的介导发挥其功能，调节机体的代谢，促进细胞有丝分裂、分化及凋亡等等。研究表明IGF、IGF-1R与肿瘤的发生发展有密切的关系。IGF-1R是一种异源二聚体跨膜蛋白酪氨酸激酶，与其配体IGF-1和IGF-2结合后发生磷酸化反应，启动信号传递链，尤其是PI3K/AKT通路，从而不仅在正常细胞的增殖、凋亡和机体生长发育，而且在恶性肿瘤细胞增殖和对抗凋亡起着关键的作用。100%的卵巢上皮性癌组织和多数卵巢癌细胞系表达IGF-1R，IGF信号通路与卵巢癌的发生、发展和预后密切相关，可促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和转移，与化疗耐药也密切相关，IGF-1R高表达与不良预后相关。因此，IGF家族是否与休眠的肿瘤细胞逸出静止期重新进入增殖期有关值得关注。本研究我们拟采用卵巢癌细胞系SKOV3建立裸鼠移植瘤模型，研究荧光高保留的PKH26^hi细胞克隆（即休眠的或处于缓慢周期的卵巢癌细胞）的“干性”，并对卵巢癌细胞系SKOV3建立裸鼠移植瘤模型进行化疗，观察顺铂（DDP）对休眠的PKH26^hi细胞的干细胞属性的影响。随后，以卵巢癌细胞SKOV3裸鼠移植瘤顺铂化疗后瘤细胞悬液为研究对象，从中分选出的具有干细胞属性的休眠的SKOV3-R-PKH26^hi细胞，应用IGF-1R抑制剂NVP，观察IGF受体通路在调控SKOV3-R-PKH26^hi细胞逸出静止期的作用以及抑制IGF受体通路后SKOV3-R-PKH26^hi细胞增殖和凋亡的变化，探讨IGF受体通路与休眠细胞启动增殖的相关性。第一部分卵巢上皮性癌移植瘤中休眠细胞的干细胞属性分析目的：肿瘤休眠不仅是恶性肿瘤细胞的生物学特征之一，也是导致肿瘤转移和复发的根源之一。本部分研究旨在探讨卵巢癌移植瘤中休眠的肿瘤细胞是否具有干细胞属性，顺铂（DDP）对休眠的肿瘤细胞干细胞属性的影响。方法：1应用PKH26荧光试剂盒标记SKOV3细胞2应用卵巢癌细胞SKOV3建立裸鼠异种移植瘤模型将PKH26标记的SKOV3细胞1×10⁷个，0.5ml PBS重悬，接种于雌性裸鼠左侧的大腿皮下，建立卵巢癌皮下异种移植瘤模型。大约两周后，当移植瘤体积大于100mm³时，将裸鼠随机分为两组即对照组和治疗组，治疗组给予DDP（4mg/kg）腹腔注射治疗，每周2次，连续3周，停药后观察肿瘤大小。当对照组移植瘤体积大于1500mm³或化疗结束后移植瘤体积维持在一定大小不再生长时实验终止。本实验中，我们将对照组的移植瘤命名为SKOV3-P肿瘤，治疗组的移植瘤命名为SKOV3-R肿瘤。3观察移植瘤生长和化疗的副反应每天观察裸鼠的一般情况，每6天测量并记录裸鼠的体重及移植瘤的体积。在实验过程中，密切观察化疗对裸鼠的副反应，包括体重的下降、行为和饮食的该变以及皮肤颜色的改变。4细胞增殖状态的分选根据PKH26荧光保留的强度，将PKH26标记的肿瘤细胞可以划分为3群：高保留细胞群(PKH26^hi细胞)、低保留细胞群(PKH26^low细胞)和荧光完全淬灭细胞群(PKH26^neg细胞)。SKOV3-P和SKOV3-R肿瘤中的PKH26^hi、PKH26^low、PKH26^neg三群细胞根据各自的荧光强度分别采用流式细胞术（FCM）进行分选。5FCM检测从SKOV3-P和SKOV3-R肿瘤中分选出的PKH26^hi、PKH26^low、PKH26^neg细胞的周期分布。6采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）方法分析SKOV3-P和SKOV3-R肿瘤中分选出的PKH26^hi、PKH26^low、PKH26^neg细胞干细胞标记物Nestin、Oct3/4、CD117的表达水平。7采用FCM方法检测SKOV3-P和SKOV3-R肿瘤中分选出的PKH26hi、PKH26^low、PKH26^neg细胞干细胞标记物Nestin、Oct3/4、CD117的蛋白表达水平。8采用体外克隆形成实验检测SKOV3-P和SKOV3-R肿瘤中分选出的PKH26^hi、PKH26^low、PKH26^neg细胞的克隆形成率。9采用体内裸鼠体内成瘤能力实验检测SKOV3-P和SKOV3-R肿瘤中分选出的PKH26^hi、PKH26^low、PKH26^neg细胞的肿瘤形成率。结果：1PKH26荧光标记试剂盒对SKOV3细胞标记的特征PKH26标记的SKOV3细胞在激光共聚焦显微镜下呈现红色，染色效率可达100%，染料在细胞膜上分布均匀一致。细胞在培养瓶中传代后，红色荧光可随着细胞的贴壁生长而逐渐减弱。2各组裸鼠移植瘤的生长和一般状况的评估给予裸鼠DDP治疗1周后（即第14天到21天），治疗组移植瘤的平均生长速度低于对照组，但两组差异无统计学意义（P>0.05）；从第14天到第35天（DDP治疗结束），DDP能够显著抑制移植瘤的生长，延缓肿瘤生长速度。第14天到28天，治疗组裸鼠移植瘤的平均生长速度为对照组1/3（P<0.05）；第28天到35天，治疗组裸鼠移植瘤的平均生长速度仅为对照组1/5（P<0.05），第35天，治疗组裸鼠移植瘤的平均体积显著小于对照组（P<0.05）。DDP治疗结束后一周（第42天），治疗组裸鼠移植瘤普遍较小，与治疗结束时（第35天）裸鼠移植瘤体积比较，差异无统计学意义（P>0.05），而与对照组比较其差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组比较，治疗组裸鼠经过DDP治疗后出现了一系列副反应，包括体重减轻（P<0.05）、短时间的嗜睡、轻微的皮肤褪色、饮食的减退（P<0.05）、白细胞减少（P<0.05）。尽管化疗引起一系列副反应，但是根据化疗副反应的分级，治疗组裸鼠化疗副反应为Ⅰ级，表明裸鼠能够一定程度的耐受化疗。3裸鼠移植瘤中存在休眠的PKH26hi细胞且DDP可以使休眠的PKH26hi细胞富集PKH26hi细胞在SKOV3-R肿瘤中所占比率（7.57%）显著高于其在SKOV3-P肿瘤中所占比率（2.89%, P=0.003），同时，PKH26low细胞在SKOV3-R肿瘤中所占比率（70.94%）也显著高于其在SKOV3-P肿瘤中所占比率（48.87%, P=0.002），然而PKH26neg细胞在SKOV3-R肿瘤中所占比率（20.58%）却显著低于其在SKOV3-P肿瘤中所占比率（46.97%,P=0.002）。4DDP对卵巢癌细胞周期分布的影响SKOV3-P和SKOV3-R肿瘤中PKH26hi细胞均处于G0/G1期，进一步证实PKH26hi细胞代表荧光高保留的、休眠的或处于缓慢周期的细胞。SKOV3-P肿瘤中PKH26low细胞大部分处于G0/G1期。与SKOV3-P肿瘤中PKH26low细胞相比较，SKOV3-R肿瘤中PKH26low细胞的S期细胞显著增多而G2/M期细胞显著减少（均P<0.05）。SKOV3-P和SKOV3-R肿瘤中PKH26neg细胞与PKH26low细胞比较，PKH26neg细胞中S期细胞增多（P=0.004和P=0.001）；与SKOV3-P肿瘤中PKH26neg细胞相比，SKOV3-R肿瘤中PKH26neg细胞中处于G0/G1期细胞减少，S和G2/M期细胞增多（P=0.2, P=0.001和P=0.47）。5休眠的PKH26hi细胞表达干细胞标记物且DDP可以增强其干细胞标记物的表达Real-time RT-PCR结果显示，干细胞标记物Nestin、Oct3/4和CD117在SKOV3-P和SKOV3-R肿瘤中PKH26hi细胞的表达均显著高于PKH26low细胞（P<0.05），PKH26neg细胞均不表达这三种干细胞标记物。SKOV3-R肿瘤中PKH26hi细胞的Nestin、Oct3/4和CD117mRNA的表达显著高于SKOV3-P肿瘤中PKH26hi细胞的表达（P=0.024，P=0.045和P=0.022）。流式细胞术检测结果显示干细胞标记物Nestin、Oct3/4和CD117蛋白在SKOV3-P和SKOV3-R肿瘤中PKH26hi细胞的表达均显著高于PKH26low细胞（P<0.05），PKH26neg细胞均不表达这三种干细胞标记物；SKOV3-R-PKH26hi细胞Nestin、Oct3/4和CD117蛋白的表达显著高于SKOV3-P-PKH26hi细胞（P=0.04, P=0.037和P=0.001）。6休眠的PKH26hi细胞显示克隆形成能力和体内成瘤能力且DDP可以增强这种干细胞样特性体外克隆形成实验结果显示，在SKOV3-P肿瘤中，PKH26hi和PKH26low细胞均具有克隆形成能力，且PKH26hi细胞的克隆形成率显著高于PKH26low细胞（t=11.029, P=0.001）。同样，在SKOV3-R肿瘤中PKH26hi细胞的克隆形成率显著高于PKH26low细胞（t=13.81, P=0.000）。SKOV3-R肿瘤中PKH26hi细胞的克隆形成率显著高于SKOV3-P肿瘤中的PKH26hi细胞（t=4.467, P=0.011），同样的差异也存在于PKH26low细胞克隆形成率的比较（t=4.35, P=0.012）。体内成瘤实验结果表明，在SKOV3-P肿瘤中，两个细胞浓度接种裸鼠后，PKH26hi细胞均可在裸鼠体内成瘤，成瘤率分别为50%和83%；PKH26low和PKH26neg细胞均未显示体内成瘤能力。在SKOV3-R肿瘤中，PKH26hi细胞在接种的两个细胞浓度均显示了较强的体内成瘤能力，成瘤率分别为83%和100%；PKH26low细胞能够在体内成瘤的细胞浓度为20,000cells/ml，成瘤率为33%，而PKH26neg细胞在接种的两个细胞浓度均未显示体内成瘤能力。与SKOV3-P-PKH26hi细胞相比， SKOV3-R-PKH26hi细胞显示了较高的体内成瘤能力。同样，SKOV3-R-PKH26low细胞与SKOV3-P-PKH26low细胞相比，也显示了较高的体内成瘤能力。结论：1卵巢癌SKOV3细胞建立裸鼠异种移植瘤中存在不同的细胞克隆（PKH26hi, PKH26low, and PKH26neg细胞），这些细胞克隆呈现不同的增殖状态、细胞周期分布和干细胞标记物的表达水平。2SKOV3-P和SKOV3-R肿瘤中的PKH26hi细胞代表休眠的或处于缓慢周期的细胞并且具有干细胞样特性。3化疗不仅可以引起PKH26hi细胞的富集而且有可能增强SKOV3-R-PKH26hi细胞的“干性”。第二部分胰岛素样生长因子受体通路对卵巢上皮性癌移植瘤中休眠细胞启动增殖的调控目的：观察IGF受体通路在调控SKOV3-R-PKH26hi细胞逸出静止期的作用，探讨IGF受体通路与休眠肿瘤细胞启动增殖的相关性。方法：本部分实验以第一部分人卵巢癌细胞SKOV3裸鼠移植瘤顺铂化疗后瘤细胞悬液为研究对象，从中分选出具有干细胞样属性的高保留PKH26细胞亚群（即SKOV3-R-PKH26hi细胞）。1免疫细胞化学法检测SKOV3-R-PKH26hi细胞中IGF-1、IGF-2和IGF-1R蛋白的表达。2酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）测定无血清培养24h，48h和72h的SKOV3-R-PKH26hi细胞的培养液中IGF-1和IGF-2蛋白的浓度。3细胞计数和MTT法测定加入不同浓度外源性IGF-1蛋白（10ng/ml、30ng/ml、50ng/ml、100ng/ml）对SKOV3-R-PKH26hi细胞增殖的影响4流式细胞术检测培养24h，48h和72h后SKOV3-R-PKH26hi细胞中IGF-1R和Ki-67蛋白的表达。5应用Western blot方法检测SKOV3-R-PKH26hi细胞中PI3K/AKT通路的激活及Cyclin B1的表达6SKOV3-R-PKH26hi细胞培养24h，48h和72h后，应用流式细胞术检测不同培养时间下SKOV3-R-PKH26hi细胞的细胞周期和凋亡率。结果：1SKOV3-R-PKH26hi细胞中IGF-1、IGF-2和IGF-1R蛋白的表达免疫细胞化学法结果显示，SKOV3-R-PKH26hi细胞的细胞膜和细胞质中均有棕黄色颗粒，说明SKOV3-R-PKH26hi细胞均可以表达IGF-1、IGF-2和IGF-1R蛋白。2SKOV3-R-PKH26hi细胞的培养液中IGF-1和IGF-2蛋白的浓度ELISA结果显示，无血清培养SKOV3-R-PKH26hi细胞24h后，培养液中IGF-1蛋白的浓度为（49.91±1.24）ng/ml，IGF-2蛋白的浓度为（93.21±2.35）ng/ml；培养48h后，培养液中IGF-1和IGF-2蛋白的浓度较24h显著升高（P<0.05），IGF-1蛋白的浓度为（78.29±1.02）ng/ml，IGF-2蛋白的浓度为（160.39±1.88）ng/ml；培养72h后，IGF-1蛋白的浓度为（105.92±6.09）ng/ml，IGF-2蛋白的浓度为（190.52±3.17）ng/ml，与24h和48h比较培养液中IGF-1和IGF-2蛋白的浓度显著升高（P<0.05）。3外源性IGF-1蛋白对SKOV3-R-PKH26hi细胞增殖的影响通过细胞计数和MTT实验的结果，提示低浓度的IGF-1对SKOV3-R-PKH26hi细胞即能发挥促增殖作用，随着IGF-1浓度的增高，对SKOV3-R-PKH26hi细胞的促增殖作用也增强，在一定范围内呈现剂量依赖关系。4SKOV3-R-PKH26hi细胞中IGF-1R和Ki-67蛋白的表达流式细胞术方法检测到SKOV3-R-PKH26hi细胞中IGF-1R和Ki-67蛋白的表达量随着培养时间的延长而显著增高（均P<0.01）。5PI3K/AKT信号通路的检测Western blot结果显示，SKOV3-R-PKH26hi细胞中p-AKT、p-GSK3β的表达水平随着培养时间的增加而显著提高（均P<0.05）。6SKOV3-R-PKH26hi细胞中Cyclin B1蛋白的表达Western blot方法检测Cyclin B1蛋白的表达，结果显示，与培养24h比较，培养48h和72h后SKOV3-R-PKH26hi细胞中Cyclin B1蛋白的表达量显著增高（均P<0.05）；培养72h后Cyclin B1蛋白的表达量高于培养48h，但是差异无统计学意义（P>0.05）。7SKOV3-R-PKH26hi细胞的细胞周期和凋亡率细胞周期分析结果显示，随着培养时间的增加，SKOV3-R-PKH26hi细胞中G0/G1期细胞显著减少（P<0.05），S期细胞显著增加（P<0.05），G2/M期细胞显著较少（P<0.05）。细胞凋亡分析结果显示，SKOV3-R-PKH26hi细胞在24h，48h，72h后的细胞凋亡率分别为（0.233±0.25）%，（0.253±0.30）%，（0.247±0.15）%，未呈现凋亡趋势，且不同时间点的凋亡率差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：1IGF-1、IGF-2和IGF-1R在SKOV3-R-PKH26hi细胞中均有表达，且随着培养时间的延长，IGF-1、IGF-2的浓度和IGF-1R蛋白的表达显著增加，提示SKOV3-R-PKH26hi细胞存在IGF自分泌。2IGF-1R通过活化PI3K/AKT信号通路能够使Cyclin B1蛋白过表达，促进G2/M期转换启动SKOV3-R-PKH26hi细胞的增殖，并可以减少SKOV3-R-PKH26hi细胞的凋亡，提示IGF受体通路能够调控卵巢癌休眠细胞的增殖。第三部分抑制胰岛素样生长因子受体通路对卵巢上皮性癌移植瘤中休眠细胞增殖和凋亡的影响目的：应用IGF-1R抑制剂NVP，观察抑制IGF-1R后SKOV3-R-PKH26hi细胞增殖和凋亡的变化，进一步探讨IGF受体通路在调控卵巢癌移植瘤中休眠细胞启动增殖方面的作用，并为卵巢癌的治疗寻找新的途径。方法：本部分实验以卵巢癌细胞SKOV3裸鼠移植瘤顺铂化疗后瘤细胞悬液为研究对象，从中分选出具有干细胞属性的高保留PKH26细胞亚群（即SKOV3-R-PKH26hi细胞）。1应用MTT法检测，加入不同浓度NVP（0μM、1μM、5μM、10μM、15μM），培养48小时，检测NVP对SKOV3-R-PKH26hi细胞增殖的影响。2应用MTT法检测，不同浓度NVP（0μM、1μM、5μM、10μM、15μM）联合IGF-1蛋白（40ng/ml），培养48小时，检测对SKOV3-R-PKH26hi细胞增殖的影响。3将SKOV3-R-PKH26hi细胞分为对照组和NVP处理组，应用流式细胞术检测NVP作用后SKOV3-R-PKH26hi细胞中IGF-1R和Ki-67蛋白的表达。4将SKOV3-R-PKH26hi细胞分为对照组和NVP处理组，培养48h后，应用流式细胞术检测NVP处理后SKOV3-R-PKH26hi细胞的周期和凋亡率。5应用MTT法检测，应用NVP（15μM）联合不同浓度的顺铂（0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml），培养48小时，分别检测对SKOV3-R-PKH26hi细胞增殖的影响。6Western blot方法检测抑制IGF受体通路后下游PI3K/AKT下游蛋白的表达7体外克隆形成能力实验检测NVP对SKOV3-R-PKH26hi细胞体外克隆形成能力的影响。8裸鼠体内成瘤实验检测NVP对SKOV3-R-PKH26hi细胞体内成瘤能力的影响。结果：1NVP对SKOV3-R-PKH26hi细胞增殖的影响MTT法结果显示不同浓度NVP对SKOV3-R-PKH26hi细胞的增殖均有抑制作用，且随浓度的增加及作用时间的延长，增殖抑制率相应增加，提示这种作用在一定范围内具有时间-剂量依赖性。NVP浓度为15μM时对SKOV3-R-PKH26hi细胞的增殖抑制最明显，因此选择15μM进行后续实验。2NVP联合IGF-1对SKOV3-R-PKH26hi细胞增殖的影响不同浓度NVP联合IGF-1蛋白（40ng/ml）作用SKOV3-R-PKH26hi细胞后，SKOV3-R-PKH26hi细胞的存活率与单用NVP时的细胞存活率比较，其差异无统计学意义（均P>0.05）。3NVP作用后SKOV3-R-PKH26hi细胞中IGF-1R和Ki-67蛋白的表达流式细胞术方法检测到NVP（15μM）作用SKOV3-R-PKH26hi细胞后IGF-1R和Ki-67蛋白的表达量较对照组细胞显著降低（P<0.05）。4NVP对SKOV3-R-PKH26hi细胞的周期和细胞凋亡率的影响NVP作用SKOV3-R-PKH26hi细胞后，G0/G1期细胞显著减少（P<0.05），而S期和G2/M期细胞显著增多（均P<0.05），提示NVP可以抑制SKOV3-R-PKH26hi细胞的增殖。流式细胞术方法检测到NVP作用SKOV3-R-PKH26hi细胞后细胞凋亡率较对照组显著增加（17.44±1.14%vs.0.25±1.76%，P<0.01），提示NVP可以促进SKOV3-R-PKH26hi细胞的凋亡。5NVP联合DDP对SKOV3-R-PKH26hi细胞增殖的抑制作用NVP联合DDP可以显著的增加DDP对SKOV3-R-PKH26hi细胞增殖的抑制作用，与单用DDP组相比，差异有统计学意义（均P<0.05），提示NVP可以增加SKOV3-R-PKH26hi细胞对DDP的敏感性。6NVP可以引起PI3K/AKT通路的失活Western blotting结果显示：NVP可以显著降低p-AKT蛋白的表达（P<0.05），其下游的关键蛋白p-GSK3β、Cyclin B1、Bcl-xL的表达也显著降低（P<0.05），Bax蛋白的表达水平显著增高（P<0.05），而总的AKT、GSK3β蛋白的表达水平无明显变化（P>0.05）。7NVP对SKOV3-R-PKH26hi细胞体外克隆形成能力的影响NVP可以降低SKOV3-R-PKH26^hi细胞体外克隆形成能力，体外克隆形成实验结果显示，对照组细胞的克隆形成率为（42.2±1.8）%，NVP作用SKOV3-R-PKH26^hi细胞后，其克隆形成率为（23.6±2.3）%，两组之间的差异有统计学意义（P<0.05）。8NVP对SKOV3-R-PKH26^hi细胞体内成瘤能力的影响NVP可以降低SKOV3-R-PKH26^hi细胞体内成瘤能力，对照组裸鼠移植瘤的成瘤率为100%（6/6），实验组裸鼠移植瘤的成瘤率为16.7%（1/6），两组成瘤率的差异有统计学意义（P=0.015）。实验组裸鼠的体重与对照组相比（19.95±0.99g vs.20.6±0.86g），差异无统计学意义（P>0.05），裸鼠一般状况良好，饮食及活动正常，未发现明显的毒副作用。4周后处死裸鼠，各器官均未发现肉眼的病理改变，取心、肝、肺、肠做病理学HE染色，均未见明显病理改变。结论：1NVP作用后，SKOV3-R-PKH26^hi细胞的增殖活性显著降低，细胞凋亡率和DDP敏感性显著增高，并可以显著降低PI3K/AKT下游细胞周期蛋白和抗凋亡蛋白的表达，提示抑制IGF-1R可以使PI3K/AKT信号通路失活，抑制休眠细胞的增殖，诱导凋亡和增加化疗敏感性。2NVP可以显著抑制SKOV3-R-PKH26^hi细胞体外克隆形成能力和体内成瘤能力，提示IGF-1R在调控休眠细胞的增殖方面发挥了重要的作用。