研究背景甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤,且发病率呈逐年上升趋势。多数甲状腺癌为分化型甲状腺癌（well-differentiated thyroid carcinoma,WDTC）,约占甲状腺癌发病率的90%。WDTC具有惰性生物学行为,经经典治疗三部曲:甲状腺全切或近全切+放射性131碘（131I）治疗+甲状腺激素抑制治疗后,总体预后良好,生存率很高。其中,放射性1311治疗起到非常重要的作用,尤其是对合并转移的患者。放射性碘治疗的基础是甲状腺癌细胞保留一定程度的摄碘能力,但部分患者在诊疗过程中发生失分化,即摄碘能力不同程度减弱甚至丧失,发生碘抵抗;同时,肿瘤生长速度加快,容易发生侵袭转移,尤其是淋巴结转移率高。由于失分化型甲状腺癌（dedifferentiated thyroid cancer,DeTC）的摄碘能力减低,放射性131I治疗难以奏效。而甲状腺癌对化疗及外照射放疗都不敏感,一旦发生转移,其治疗十分棘手。因此,如何改善失分化型甲状腺癌的摄碘能力及抑制其侵袭转移成为研究热点。内源性逆转录酶（endogenous reverse transcriptase,RT）基因在低分化细胞、未分化细胞、转化细胞、变异细胞及胚胎组织中高表达,而在高分化细胞及非病理性组织中低表达甚至不表达,这提示RT可能与细胞的增殖、分化有关。研究发现RT参与多种肿瘤的发生发展,而奈韦拉平作为一种非核苷逆转录酶抑制剂,可以抑制黑色素瘤、前列腺癌等多种肿瘤细胞的生长并诱导再分化。但在甲状腺癌中研究甚少,失分化型甲状腺癌中几乎无研究。鉴于以上理论,本课题以失分化型甲状腺癌WRO 82-1及dFTC-133细胞为研究对象,研究奈韦拉平对细胞增殖、侵袭转移及摄碘能力的影响及其机制,并以WRO 82-1细胞构建裸鼠种植瘤模型,在裸鼠体内进一步验证奈韦拉平对侵袭转移及摄碘能力的作用。本研究旨在探讨奈韦拉平在治疗失分化型甲状腺癌中的作用及其机制,为临床患者的治疗提供新的思路与依据。第一部分奈韦拉平对失分化型甲状腺癌摄碘能力的影响及机制探讨研究目的1.观察奈韦拉平对失分化型甲状腺癌细胞摄碘能力的影响。2.明确奈韦拉平调控失分化型甲状腺癌细胞摄碘能力的机制。3.动物实验进一步验证奈韦拉平对失分化型甲状腺癌摄碘能力的影响。研究方法1.人失分化型甲状腺癌WRO 82-1细胞及人滤泡状甲状腺癌FTC-133细胞培养。2.构建失分化滤泡状甲状腺癌dFTC-133细胞株。通过131碘照射FTC-133构建失分化型甲状腺癌dFTC-133细胞株。用15 μCi 131碘照射FTC-133细胞3天,然后在基础培养基中培养3个月,挑选单克隆细胞继续培养。摄碘率最低的克隆细胞群被定义为dFTC-133细胞,与碘转运相关的基因NIS、TSHR及TPO表达均明显减少。3.运用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测奈韦拉平对WRO 82-1及dFTC-133细胞增殖的影响。将不同浓度的奈韦拉平（100、200、350和500μM）加入WRO 82-1及dFTC-133细胞中,在不同时间点（24、48及72小时）采用CCK-8实验检测细胞的增殖情况。4.运用流失细胞学技术检测奈韦拉平对WRO 82-1及dFTC-133细胞凋亡的影响。运用不同浓度的奈韦拉平（100、200、350和500 μM）分别处理WRO 82-1及dFTC-133细胞24、48及72小时,采用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒在流式细胞仪检测不同浓度不同时间点时细胞的凋亡情况。5.构建慢病毒载体干扰PAX8表达。运用慢病毒技术敲低PAX8基因表达,分别转染WRO 82-1及dFTC-133细胞48细胞形成稳转细胞株,通过实时定量PCR（qRT-PCR）技术和蛋白质印迹法（western blot）检测PAX8基因干扰效率。6.运用qRT-PCR技术检测奈韦拉平对甲状腺分化相关基因TSHR、NIS、TPO及甲状腺转录因子-甲状腺转录因子-1（TTF-1）、甲状腺转录因子-2（TTF-2）及配对盒基因8（PAX8）mRNA水平的影响。将不同浓度奈韦拉平（100 μM和200 μM）加入细胞中处理72小时,利用qRT-PCR技术检测摄碘相关基因（TSHR、NIS和TPO）及甲状腺转录因子（TTF-1、TTF-2及PAX8）mRNA表达水平。7.运用免疫荧光共聚焦（IF）技术及western blot技术检测奈韦拉平对NIS蛋白定位及表达水平的影响;运用western blot技术检测奈韦拉平处理后PAX8、TSHR、cAMP及pCREB（Ser133）蛋白表达水平的变化。将不同浓度奈韦拉平（100μM和200μM）加入细胞中处理24、48及72小时,运用western blot技术检测NIS蛋白在细胞质和细胞膜中的表达情况;为进一步探索奈韦拉平对NIS定位表达的影响,运用200 μM奈韦拉平处理细胞72小时,利用IF技术观察NIS分别在细胞质与细胞浆中的定位表达情况。为探索奈韦拉平上调NIS表达的机制,运用100μM和200μM奈韦拉平处理细胞72小时,western blot技术检测PAX8、TSHR、cAMP及pCREB（Ser133）蛋白表达水平。并运用cAMP抑制剂SQ22536干预细胞抑制TSHR/cAMP/CREB/PAX8通路,运用western blot技术观察通路抑制效果,进一步检测PAX8、NIS蛋白表达以明确奈韦拉平是否通过激活TSHR/cAMP/CREB/PAX8通路上调NIS蛋白表达。8.运用放射性125碘检测奈韦拉平对细胞摄碘率的影响。为明确奈韦拉平对细胞摄碘能力的影响,将细胞预先用100 μM和200μM奈韦拉平分别处理24、48及72小时,继而用2 μCi Na125I处理细胞30分钟后,500 μ1甲酸裂解细胞20分钟,收集细胞裂解物用伽马计数仪检测放射性活度。9.运用WRO 82-1细胞构建失分化型甲状腺癌裸鼠皮下移植瘤模型。4周龄雄性裸鼠适应性喂养1周,每只裸鼠皮下注射1×106细胞,10天后开始150 mg/kg/day奈韦拉平灌胃处理,每周5天。10.运用放射性131碘检测裸鼠甲状腺及移植瘤摄碘率。奈韦拉平灌胃处理裸鼠3周后,10μCi Na125I腹腔注射,分别在注射后4、24及48小时处死裸鼠,运用伽马计数仪检测甲状腺及移植瘤的放射性活度。11.运用免疫组织化学染色（IHC）检测移植瘤及人正常甲状腺组织中NIS蛋白表达情况。取肿瘤组织及甲状腺组织固定于4%多聚甲醛1天,然后脱水石蜡包埋,切割成4 μm薄片,经脱蜡、再水化及抗原修复后,应用NIS抗体检测甲状腺移植瘤及甲状腺组织中NIS蛋白表达水平。研究结果1.低剂量奈韦拉平显著抑制两种细胞增殖,抑制作用呈浓度和时间依赖性,但并不明显促进细胞凋亡。低浓度奈韦拉平（100 μM和200 μM）处理细胞72小时并未见细胞明显凋亡（均P>0.05）,但细胞抑制率明显增加。200 μM奈韦拉平处理细胞72小时后,WRO 82-1 及dFTC-133细胞生存率分别为74.9±3.1%and 77.4±2.8%（均P<0.05）。2.奈韦拉平显著增加甲状腺分化相关基因TSHR、NIS及甲状腺转录因子PAX8表达。qRT-PCR结果显示,奈韦拉平明显增加PAX8、TSHR及NIS mRNA表达水平,TPO、TTF-1和TTF-2 mRNA水平未见增加。200 μM奈韦拉平处理WRO 82-1及dFTC-133细胞72小时后,与阴性对照组相比,TSHR mRNA分别增加3.7倍和3.0倍,PAX8 mRNA分别增加2.9倍和2.8倍,NIS mRNA分别增加1.9倍和1.8倍（均P<0.05）。3.奈韦拉平增加失分化型甲状腺癌NIS蛋白的膜定位。Western blot实验发现NIS蛋白在胞膜中的表达水平明显增加,且呈浓度依赖性和时间依赖性。200 μM奈韦拉平处理72小时后,较阴性对照组,NIS蛋白的胞膜/胞浆比值分别增加1.8倍和1.9倍;较奈韦拉平处理24小时组,NIS蛋白的胞膜/胞浆比值分别增加1.3倍和1.6倍（均P<0.05）。免疫荧光共聚焦实验进一步证实,较胞浆NIS表达水平,奈韦拉平增加细胞膜上NIS表达水平更显著。4.奈韦拉平增加失分化型甲状腺癌细胞摄碘率。体外细胞摄碘率实验表明,奈韦拉平呈时间和浓度双依赖性增加细胞摄碘率。200 μM奈韦拉平处理72小时后,WRO 82-1和dFTC-133细胞摄碘率较阴性对照组分别增加1.7倍和2.1倍;200 μM奈韦拉平处理24、48和72小时后,WRO 82-1摄碘率分别增加1.3倍、1.4倍和1.8倍,dFTC-133细胞摄碘率分别增加1.3倍、1.6倍和2.1倍（均P<0.05）。5.奈韦拉平显著增加PAX8蛋白表达水平,而PAX8是介导奈韦拉平调控NIS表达及摄碘能力的关键因素。Western blot结果表明,200 μM奈韦拉平处理WRO 82-1和dFTC-133细胞72小时,PAX8蛋白表达水平较阴性对照组分别增加2.7倍和2.2倍（均P<0.05）。运用慢病毒敲低PAX8蛋白水平后,NIS蛋白表达及细胞摄碘率明显下调（均P<0.05）。这些结果表明PAX8与NIS蛋白表达上调、细胞摄碘率增加有关,而且是介导奈韦拉平调控NIS表达及摄碘能力的关键因素。6.奈韦拉平能够激活TSHR/cAMP/CREB/PAX8通路,从而上调细胞摄碘率。Westernblot结果表明,奈韦拉平明显增加甲状腺激素受体（TSHR）、环磷酸腺苷（cAMP）及环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）磷酸化水平（均P<0.05）,给予cAMP抑制剂SQ22536处理后,上调表达的TSHR、cAMP及pCREB（Ser133）蛋白被抑制,NIS蛋白表达及细胞摄碘率也被抑制（均P>0.05）,提示奈韦拉平增加NIS蛋白表达及细胞摄碘率的作用是激活TSHR/c AMP/CREB/P AX8通路实现的。7.奈韦拉平抑制失分化型甲状腺癌裸鼠移植瘤生长。为了进一步证实上述体外实验的结果,我们构建裸鼠移植瘤模型,进行体内实验。奈韦拉平灌胃处理3周后,裸鼠移植瘤体积明显减小,较对照组移植瘤体积减少51.3±3.1%（均P<0.05）。8.奈韦拉平增加裸鼠移植瘤NIS蛋白表达及摄碘率水平。IHC结果显示,正常甲状腺组织NIS阳性率为39.5%±1.9%,奈韦拉平处理组NIS阳性率为30.4%±1.8%,阴性对照组NIS阳性率为18.2%±0.8%。奈韦拉平灌胃处理组NIS蛋白阳性率为阴性对照组的1.7倍,是正常甲状腺组织的0.8倍（均P<0.05）。Na125I腹腔注射后,细胞摄碘率随着时间推移逐渐增加,48小时达到峰值,奈韦拉平灌胃处理组移植瘤/甲状腺摄碘率比值为0.93±0.04（均P<0.05）。研究结论1.奈韦拉平能显著抑制失分化型甲状腺癌WRO 82-1及dFTC-133细胞增殖。2.奈韦拉平显著提高细胞摄碘率,其机制是通过激活TSHR/cAMP/CREB/PAX8通路上调NIS蛋白表达,并促进NIS蛋白的膜定位。3.奈韦拉平显著抑制失分化型甲状腺癌裸鼠移植瘤生长;并显著上调裸鼠移植瘤NIS蛋白表达及肿瘤的摄碘能力。第二部分奈韦拉平对失分化型甲状腺癌侵袭转移的影响研究目的1.动物实验检测奈韦拉平对失分化型甲状腺癌侵袭转移的影响。2.观察奈韦拉平对失分化型甲状腺癌细胞侵袭转移的影响。3.探索奈韦拉平调控失分化型甲状腺癌细胞侵袭转移的可能机制。研究方法1.构建失分化型甲状腺癌裸鼠皮下移植瘤模型。2.苏木精-伊红（HE）染色检测甲状腺癌细胞远处转移。组织用4%多聚甲醛固定24小时,脱水、石蜡包埋,切成4 μm薄片,经脱蜡再水化后,用苏木精和伊红染色,显微镜下观察细胞形态。3.培养失分化型甲状腺癌WRO 82-1细胞。4.Tranwell小室迁移/侵袭实验检测奈韦拉平对细胞迁移、侵袭的影响。200 μM奈韦拉平处理细胞72小时,采用Tranwell小室迁移/侵袭实验观察奈韦拉平对细胞迁移、侵袭功能的影响。5.qRT-RCR及west3tern blot实验检测VEGFA、MMP2及MMP9表达。为观察奈韦拉平对侵袭相关指标的影响,用200 μM奈韦拉平处理细胞72小时,qRT-RCR及western blot实验从mRNA及蛋白水平分别检测VEGFA、MMP2及MMP9表达水平。6.qRT-RCR实验检测IL-6 mRNA表达水平,western blot技术检测JAK2及STAT3蛋白磷酸化程度。为探求奈韦拉平抑制失分化型甲状腺癌细胞侵袭转移是否与IL-6/JAK2/STAT3通路有关,采用qRT-RCR实验检测IL-6 mRNA表达水平,western blot技术检测pJAK2（Y1007+Y10.08）及pSTAT3（Tyr705）蛋白水平。研究结果1.动物实验表明奈韦拉平显著抑制失分化型甲状腺癌肝转移。HE染色结果显示,裸鼠移植瘤发生肝转移,奈韦拉平灌胃处理组转移明显减少,阴性对照组肝脏可见更多转移灶,表现为梭形细胞、非典型巨大细胞伴随病理性有丝分裂。2.奈韦拉平显著抑制失分化型甲状腺癌细胞侵袭转移及相关基因VEGFA、MMP2及MMP9表达。Tranwell小室迁移/侵袭实验显示,200 μM奈韦拉平处理72小时后,细胞迁移、侵袭功能均被明显抑制,迁移率减少至34.38±2.35%,侵袭率下调至31.47±2.76%（均P<0.05）。qRT-RCR及western blot实验显示,奈韦拉平明显抑制VEGFA、MMP2及MMP9 mRNA及蛋白表达水平（均P<0.05）。3.奈韦拉平抑制细胞侵袭转移可能与抑制IL-6/JAK2/STAT3通路有关。qRT-RCR实验显示,奈韦拉平明显抑制IL-6 mRNA水平（P<0.05）,western blot实验显示奈韦拉平明显抑制pJAK2（Y1007+Y1008）及pSTAT3（Tyr705）蛋白磷酸化水平（均P<0.05）。200 μM奈韦拉平处理72小时后,pJAK2（Y1007+Y1008）及pSTAT3（Tyr705）蛋白磷酸化水平分别减少56.0%和46.1%。提示奈韦拉平抑制失分化型甲状腺癌细胞侵袭转移可能与IL-6/JAK2/STAT3通路有关。研究结论1.体内外实验均显示:奈韦拉平显著抑制失分化型甲状腺癌肝转移。2.细胞实验显示:奈韦拉平显著抑制失分化型甲状腺癌WR082-1细胞侵袭转移,该作用可能是通过抑制IL-6/JAK2/STAT3通路实现的。