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背景肠缺血再灌注（ischemia reperfusion,I/R）损伤是一种临床中常见的器官损伤,可导致多器官功能障碍,围手术期发病率和病死率极高,但目前尚缺乏有效的防治措施。研究表明,自噬在肠I/R损伤的发生发展中扮演重要角色,但是其确切作用仍有争议。miR-146a-5p近来被证明可以调控肠I/R时的细胞炎症反应,减轻肠I/R损伤;同时miR-146a-5p参与了多种细胞自噬的调控,但其是否调控肠I/R时的肠粘膜上皮细胞自噬及其调控机制,目前尚不清楚。TXNIP是一种多功能生物反应调节蛋白,且被预测到可能是miR-146a-5p的靶基因。研究报道,TXNIP上调可以促进肠粘膜上皮细胞焦亡,加重肠I/R损伤。此外,TXNIP被证明参与了自噬的调控,但TXNIP是否调控肠I/R肠粘膜上皮细胞自噬及其与miR-146a-5p的关系,目前尚无相关报道。PRKAA是AMPK的催化亚基,可以通过磷酸化激活,进而抑制mTORC1复合体的活性启动自噬。PRKAA/mTOR信号通路是自噬的经典调控通路之一,且本研究通过数据库预测发现TXNIP与PRKAA之间存在潜在的相互作用关系。综上,本研究推测:miR-146a-5p/TXNIP轴通过PRKAA/mTOR信号通路调控肠I/R肠粘膜上皮细胞自噬。目的本研究拟通过构建小鼠肠I/R模型和Caco-2细胞OGD/R模型,利用多种分子生物学手段,探讨自噬在肠I/R损伤中的作用及其具体调控机制,为肠I/R损伤临床防治提供新思路和新靶点。方法本研究利用野生型C57BL/6J小鼠和肠粘膜上皮miR-146a-5p特异性过表达的转基因小鼠,采用肠系膜上动脉结扎60 min,恢复灌注120 min的方法构建小鼠肠I/R损伤模型;采用在无糖无氧环境（PBS,95%N2+5%CO2）培养4 h后,转入正常环境（完全培养基,空气+5%CO2）培养0-4 h的方法构建Caco-2细胞氧糖剥夺/复氧（oxygen glucose deprivation reoxygenation,OGD/R）模型。本研究设计构建TXNIP过表达（TXNIP OE）和TXNIP敲减（TXNIP KD）慢病毒并转染Caco-2细胞以建立TXNIP OE和TXNIP KD稳定细胞系;采用miR-146a-5p inhibitor和miR-146a-5p mimic转染Caco-2细胞以抑制和过表达miR-146a-5p。采用Elisa法检测小鼠血清DAO浓度;制备小鼠肠组织病理切片进行HE染色,观察肠组织病理学变化并用Chiu氏评分法评估小鼠肠组织病理学损伤;制备小鼠肠组织超薄切片,利用透射电子显微镜观察小鼠肠组织自噬体形成情况;采用CCK-8法检测细胞存活率;采用RT-PCR法检测小鼠肠组织和Caco-2细胞中miR-146a-5p和TXNIP m RNA的表达水平;采用Western blot检测小鼠肠组织和Caco-2细胞中TXNIP、LC3、Beclin-1和SQSTM1蛋白的表达水平和PRKAA、P70 S6K的磷酸化水平;采用免疫荧光法检测Caco-2细胞LC3B的表达水平;采用双荧光素酶报告基因检测miR-146a-5p与TXNIP之间的靶向关系;采用免疫荧光共定位法观察TXNIP与p-PRKAA在Caco-2细胞中的空间定位关系;采用免疫共沉淀法检测TXNIP与p-PRKAA在Caco-2细胞中的相互结合关系。结果1.小鼠肠I/R和Caco-2细胞OGD/R后,肠组织和Caco-2细胞自噬水平明显上调,组织和细胞损伤加重;利用自噬抑制剂氯喹（chloroquine,CQ）抑制自噬后,小鼠肠组织和Caco-2细胞自噬水平被抑制,组织和细胞损伤减轻。这表明小鼠肠I/R和Caco-2细胞OGD/R导致自噬的过度激活,加重了小鼠肠组织和Caco-2细胞损伤。2.小鼠肠I/R和Caco-2细胞OGD/R后,肠组织和Caco-2细胞中miR-146a-5p表达下调,TXNIP m RNA和蛋白表达上调;此外,miR-146a-5p可以与TXNIP的3′UTR结合负向调控TXNIP的表达。抑制miR-146a-5p的水平可以上调TXNIP的表达,进一步激活自噬,加重Caco-2细胞OGD/R损伤;而过表达miR-146a-5p可以下调TXNIP的表达,抑制自噬水平,减轻Caco-2细胞OGD/R损伤。这表明,Caco-2细胞OGD/R时,miR-146a-5p可能靶向TXNIP调控自噬。3.TXNIP OE细胞系中,OGD/R后Caco-2细胞PRKAA蛋白磷酸化水平上调,P70 S6K蛋白磷酸化水平下调,自噬进一步激活,Caco-2细胞OGD/R损伤进一步加重;而在TXNIP KD细胞系中,OGD/R后PRKAA蛋白磷酸化水平下调,P70 S6K蛋白磷酸化水平上调,自噬水平下降,Caco-2细胞OGD/R损伤减轻。免疫荧光共定位显示在OGD/R时,TXNIP与p-PRKAA在Caco-2细胞中共定位;免疫共沉淀正拉、反拉实验均证明了TXNIP与p-PRKAA在Caco-2细胞OGD/R时的互相结合。这些表明,TXNIP可以与p-PRKAA相互作用促进PRKAA的磷酸化,进而通过PRKAA/mTOR信号通路调控Caco-2细胞OGD/R时的自噬。4.miR-146a-5p mimic在野生型Caco-2细胞中通过抑制自噬,减轻细胞OGD/R损伤的作用在TXNIP OE细胞系中被部分逆转。这表明,TXNIP介导了miR-146a-5p对Caco-2细胞OGD/R时自噬的调控作用。在肠粘膜上皮miR-146a-5p特异性过表达的转基因小鼠中,小鼠肠I/R后肠组织TXNIP下调,PRKAA的磷酸化水平降低,P70 S6K的磷酸化水平升高,自噬被抑制,肠组织I/R损伤明显减轻。这表明,miR-146a-5p可以靶向TXNIP,通过PRKAA/mTOR信号通路调控小鼠肠I/R肠粘膜上皮细胞自噬。结论1.自噬的过度激活是肠I/R肠损伤的重要机制,抑制自噬可以减轻肠I/R肠损伤;2.miR-146a-5p可以靶向下调TXNIP表达水平,抑制自噬,减轻肠I/R肠损伤;3.TXNIP可以通过与p-PRKAA相互作用促进PRKAA的磷酸化,进而通过PRKAA/mTOR信号通路促进自噬,加重肠I/R肠损伤;4.miR-146a-5p/TXNIP轴通过PRKAA/mTOR信号通路抑制自噬,减轻肠I/R肠损伤。本研究表明,上调miR-146a-5p的表达、下调TXNIP的表达和抑制自噬可能是肠I/R损伤临床防治新靶点。