一、研究背景和目的胃肠道是人体重要的内分泌器官,胃肠功能对于血糖的调控具有重要意义。一方面,高血糖可以影响胃肠动力,引起恶心、呕吐、腹痛、饱胀等不适症状,影响血糖控制;另一方面,胃肠动力的改变影响营养物质吸收和胃肠激素分泌也会引起血糖变化。所以调节胃肠动力的治疗手段可以用来干预高血糖。胃肠肌电活动与胃肠动力密切相关。目前已知高血糖可以引起胃电节律紊乱。然而,小肠肌电活动测量困难,是否高血糖可引起小肠电节律紊乱的研究极少。自主神经功能障碍也是糖尿病患者的重要并发症,但它在高血糖诱导的肠电节律紊乱中的作用尚不知晓。因此,本研究探索了高血糖对于小肠肌电活动的影响和机制,以及自主神经在其中的作用。前期研究:在肥胖动物模型中发现,肠电刺激(IES)可影响胃肠动力、胃肠激素的分泌、营养物质的吸收、从而减轻体重,有望成为2型糖尿病患者的新治疗手段之一。本研究(1)在2型糖尿病动物模型中,探索了IES对于血糖的急性及慢性作用;(2)从胃肠动力、胃肠激素、食欲、体重、胰岛功能等方面探讨了IES发挥降糖作用的可能机制。二、方法1、高血糖诱导小肠电节律紊乱伴自主神经功能失调(1)实验动物:雄性自发性糖尿病Goto-Kakizaki(GK)大鼠和对照Wistar Kyoto(WKY)大鼠;所有大鼠在试验前接受十二指肠电极埋置手术和胸部皮下心电图电极埋置手术。(2)记录小肠肌电活动和心电图。(1)频谱分析小肠肌电活动和心电信号。主要参数包括:慢波的主要频率(DF),主功率(DP),正常小肠慢波频率百分比(%of NSW),每分钟快波锋电位数量。(2)同时分析心电图中心率变异(HRV),提取低频(LF)和高频(HF)信号,计算LF/HF比值评估自主神经功能。(3)测定糖基化血红蛋白水平(Hb A1c)以及口服葡萄糖耐量试验(OGTT)中不同时间点的血糖。计算血糖曲线下面积(AUC)。(4)另一组WKY大鼠给予注射胰高血糖素、模拟高血糖状态,观察血糖变化和小肠电节律、心脏自主神经功能的改变。(5)分析血糖水平和小肠慢波节律规整性的相关性。2、小肠电刺激对2型糖尿病大鼠血糖调节的急性作用及机制(1)实验动物:20只雄性GK大鼠、10只WKY大鼠,试验前均接受十二指肠电极埋置手术,电极导线自大鼠颈背部皮下穿出,外接刺激器。(2)分组:选择两组刺激参数与无刺激状态(Sham组)比较降糖效果。参数1组:波宽3ms,波幅2mA,脉冲0.6s on,0.9s off,频率40Hz,该参数被认为可以改变胃肠动力。参数2组:波宽0.3ms,其余与参数1相同,该参数被认为可以提高自主神经活性。另有Sham组作对照。选择两组IES中最有效的参数进行下面的研究。(3)OGTT,测定0,15,30,60,120,180min血糖,观察急性IES降糖效果。同时尾静脉采血ELISA法测定0,30,60,120min血胰岛素、胰高血糖素样肽1(GLP-1)水平。(4)胰岛素耐量试验(ITT),测定0,30,60,120min血糖,观察急性IES对胰岛素敏感性的影响。(5)急性IES联合GLP-1拮抗剂使用,观察OGTT中血糖变化,探索GLP-1在急性IES中作用。(6)急性IES对固体胃排空及小肠转运的影响。3、小肠电刺激对2型糖尿病大鼠血糖调节的慢性作用及机制(1)实验动物:20只雄性GK大鼠和10只WKY大鼠,试验前均在十二指肠慢性埋置一对电极,电极导线通过外接tether系统,连接于刺激器。(2)分组:GK鼠随机分为IES组和Sham组:(1)IES组接受持续8周每夜12h连续刺激(0.6s on,0.9s off,40Hz,3ms,2m A)。(2)Sham组和WKY组不刺激作对照。比较IES与Sham组差异。(3)BioDAQ进食监测系统连续自动监测记录大鼠每日进食状况。(4)每周监测体重、空腹血糖(FBG)变化。(5)基线、4周、8周进行OGTT,比较IES和Sham组血糖差异。(6)基线、8周检测HbA1c、ITT,(7)第8周OGTT同步采血测定胰岛素、GLP-1水平。(8)慢性IES对胰腺重量,胰岛形态、β细胞数量的影响。三、结果1、高血糖诱导小肠电节律紊乱伴自主神经功能失调(1)糖尿病大鼠OGTT:血糖及AUC明显高于正常大鼠。(2)糖尿病大鼠空腹和餐后小肠电节律的规律性减低(P<0.001)。(3)糖尿病大鼠迷走神经活性减低,交感迷走神经平衡指数升高(P<0.05)。(4)糖尿病和正常大鼠小肠慢波规律性与HbA1c水平负相关(r=-0.663,P=0.000)。(5)注射胰高血糖素诱导的正常大鼠暂时性血糖升高,导致小肠慢波紊乱,小肠动力减低。(6)注射胰高血糖素后,正常大鼠迷走活性减低,交感迷走神经平衡指数升高。(7)注射胰高血糖素后,血糖的升高与小肠慢波规律性负相关(r=-0.739,P=0.015)。2、小肠电刺激对2型糖尿病大鼠血糖调节的急性作用及机制(1)与Sham组相比:(1)IES-3ms组明显降低OGTT前30min血糖(P<0.001)。(2)60min~120min,IES-3ms和IES-0.3ms均降低血糖16-20%(P<0.05)。(3)两参数组OGTT血糖AUC无差异。(2)ITT血糖水平:IES-3ms和Sham组无差异,即IES未改变胰岛素敏感性。(3)GLP-1拮抗剂阻断了IES 30~60min的降糖效果(P<0.05)。(4)IES提高了糖负荷后30min GLP-1分泌和胰岛素分泌(P<0.05)。(5)急性IES-3ms,加快了小肠转运(P=0.004),但是没有改变胃排空。(三)小肠电刺激对2型糖尿病大鼠血糖调节的慢性作用及机制(1)糖负荷后血糖:(1)治疗4周末,IES仅降低30min血糖(P<0.05)。(2)治疗8周末,IES明显降低15min-120min血糖20-30%(15min和30min P<0.02,60min,90min和120min P<0.01)。(3)IES组0min血糖下降13%(P<0.02),OGTT血糖AUC减少22%(P=0.002)。(2)IES降低空腹血糖10%-15%(第6周末P<0.05,第8周末P<0.01,第7周末P=0.07)。(3)IES减轻体重:慢性IES在第8周减重10%(P<0.05),但是对食欲没有明显影响(P>0.05)。(4)HbA1c:IES明显降低HbA1c水平6%(P<0.05),HbA1c的改变与体重减低无关(R~2=0.153,P>0.05)。(5)血GLP-1和胰岛素水平:8周治疗末,IES组空腹和OGTT 30min,GLP-1水平明显高于Sham组。IES提高了30min血胰岛素水平(P<0.05),但是没有改变胰岛素曲线下面积(P>0.05)。(6)胰腺重量:Sham组体重标化的胰腺重量明显低于WKY组(P<0.05)。而IES组胰腺重量与WKY组无差异。(7)胰岛的形态和功能:在一定范围内,慢性IES可提高胰岛β细胞数量,恢复胰岛的形态和结构,调节α和β细胞比例。四、结论1、自发性高血糖和胰高血糖素诱导的高血糖状态,均导致小肠肌电活动障碍。自主神经功能损害可能参与了高糖诱导的小肠电节律紊乱。2、急性IES:可降低2型糖尿病大鼠糖负荷后血糖。其降糖作用可能通过GLP-1介导。胃肠动力和自主神经调控均参与了IES的作用。3、慢性IES:可降低餐后及空腹血糖,其降糖作用可能通过调控GLP-1分泌、改善胰岛β细胞功能实现。