癌症是严重危害全球人类生命健康的主要公共卫生问题,根据世界卫生组织发布的全球癌症报告,预计到2035年全球肿瘤患者将达到2400万人。结肠癌作为一种常见消化道恶性肿瘤,在2018年其死亡率约为11.6%,成为癌症相关性死亡的第二大因素。近年来,随着生活水平的提高和饮食习惯的改变,我国已成为结肠癌的高发地区。结肠癌目前的临床治疗(手术结合放射性及化学疗法)具有一定局限性,而传统化疗药物的毒副作用是导致患者复发转移以及预后差的主要原因。天然产物功能分子以其明确的抗癌活性、多靶点、低毒性等优势,一直以来都是抗癌药物筛选的重要资源。燕麦(Avena sativa L.)是一年生禾本科植物,种植资源丰富,是一种世界性栽培作物。燕麦是高寒地区重要的粮饲兼用作物,富含β-葡聚糖、燕麦皂苷、黄酮、维生素及燕麦生物碱(AVNs)等多种生物活性成分;并具有多种保健功能,如降低心血管疾病发生、降低II型糖尿病及消化道疾病的发病风险。流行病学调查结果显示,食用全谷物食品可有效预防结肠癌的发生。目前临床应用最为广泛的植物源抗肿瘤药物主要是生物碱类,如长春新碱,以高效低毒等特点受到广泛认可,成为多种肿瘤治疗的首选药物。AVNs是燕麦独特的生物碱类化合物,研究表明其具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤及抗动脉粥样硬化等作用,然而AVNs中发挥抗肿瘤作用的具体活性成分、直接作用靶点以及潜在的分子机制并不清楚。本研究以燕麦加工副产物——燕麦麸皮为原材料,利用醇提法提取了AVNs,首次在体内外评价了其抗结肠癌活性。我们通过“分子垂钓”技术,鉴定出燕麦生物碱AVN A是AVNs中发挥抗肿瘤效应的主要活性成分。应用细胞、人结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤及AOM/DSS小鼠原位结肠癌等模型,分别从细胞凋亡、细胞衰老以及化疗增敏等方面对AVN A的抗结肠癌效应及分子机制进行了系统性研究。主要研究内容及结果如下:(1)AVNs的制备及体内外抗结肠癌活性评价。利用乙醇提取燕麦麸皮中的生物碱类物质,采用大孔树脂AB-8进行纯化除杂,经液相色谱-串联质谱法(HPLC/MS)进行主成分比对,鉴定发现提取产物为AVNs。利用MTT、细胞克隆形成、细胞凋亡及EdU等实验手段检测了AVNs对结肠癌细胞增殖的影响。结果表明AVNs有效抑制了结肠癌细胞的生长。通过体外模拟实体瘤缺氧、缺糖及低pH的肿瘤微环境,发现结肠癌细胞在应激环境下对AVNs更敏感。构建裸鼠皮下成瘤动物模型,研究显示AVNs干预可明显抑制小鼠肿瘤生长。(2)AVNs诱导结肠癌细胞凋亡的分子机制及胞内作用靶点的发现。免疫荧光实验及透射电镜形态学观察结果均显示:AVNs干预导致了线粒体形态发生明显改变,肿胀型形态显著增加;另外,线粒体有氧呼吸途径受阻,ATP产量降低。AVNs处理破坏了电子传递链(ETC)复合体,继而引发活性氧(ROS)水平升高,导致肿瘤细胞氧化应激,线粒体膜通透性转换孔(MPTP)打开,线粒体膜电位(MMP)丧失,细胞色素c释放以及caspase 3活化介导的内源性凋亡。进一步研究发现,具有调控线粒体翻译功能的RNA解螺旋酶DDX3是AVNs的胞内作用靶点,AVNs处理可引起DDX3泛素化降解,进而导致由线粒体编码的ETC复合体关键亚基合成受阻,细胞处于氧化应激状态并诱发凋亡。(3)探究AVNs中靶向DDX3发挥抗癌作用的活性成分及具体作用位点。通过原核表达纯化His-DDX3融合蛋白,利用Biacore T200分子互作仪反向垂钓AVNs中与DDX3发生相互作用的成分。经过质谱及~1H NMR检测,鉴定出AVN A是AVNs中与DDX3结合的分子。采用Autodock 6软件模拟AVN A-DDX3的结合模型,发现AVN A可能与DDX3的4个氨基酸形成氢键:Lys255、Arg287、Ser290和Arg294。通过对以上氨基酸位点进行点突变,我们发现AVN A可以与DDX3的Arg287和Arg294两个位点结合并诱导DDX3降解。采用AOM/DSS小鼠结肠癌原位模型评价AVN A体内的抗结肠癌活性。建模之前给予小鼠口服AVN A处理,可显著降低小鼠结肠癌的生长,说明AVN A对结肠癌发生发展具有一定防治作用。小鼠血清样本核磁共振结果进一步说明,AVN A抗肿瘤需要依赖于其对线粒体能量代谢的改变。(4)AVN A诱导结肠癌细胞衰老及机制研究。通过对AOM/DSS模型组及AVN A干预组小鼠的肠道肿瘤切片进行免疫组化染色,发现AVN A处理后Ki67下调,γ-H2AX发生高表达。值得注意的是,HE染色结果显示AVN A对小鼠正常器官无明显毒副作用。细胞实验结果表明,AVN A干预导致结肠癌细胞表现出体积增大、衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性升高、G1期停滞并促进p21蛋白表达等衰老特征,但AVN A处理并不会引起正常结肠细胞FHC的衰老。AVN A处理使得miR-129-3p表达显著升高,进而对其靶基因如p53的泛素连接酶Pirh2、胰岛素样生长因子2-mRNA结合蛋白3(IGF2BP3)和周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)的表达产生抑制作用。AVN A通过上调miR-129-3p导致Pirh2受到抑制,间接促进了p53及p21的表达水平增加,随后诱导了结肠癌细胞衰老。(5)AVN A与5-氟尿嘧啶(5-FU)联合促进结肠癌对5-FU化疗敏感性机制研究。本研究发现AVN A与5-FU联合使用,通过降低原癌基因miR-17-92簇的表达上调了促凋亡蛋白Bim的表达,从而提高结肠癌对5-FU的敏感性。利用生物信息学分析及实验验证筛选,确定赖氨酸特异性去甲基化酶4C(KDM4C)是miR-17-92的编码基因MIR17HG直接的转录调控因子。染色质免疫共沉淀结果显示AVN A干预或敲减KDM4C,均导致MIR17HG启动子区的转录抑制性标志——H3K9me3水平明显升高。在结肠癌细胞中过表达KDM4C可逆转AVN A对miR-17-92簇的抑制作用,表明AVN A抑制了MIR17HG基因的转录。AVN A通过抑制KDM4C/MIR17HG/Bim信号通路,增强了5-FU对结肠癌的疗效。利用裸鼠成瘤模型评价了AVN A与5-FU联合使用在体内的效果,结果显示共同处理组瘤体积明显小于单独处理组(AVN A组或5-FU组)。AVN A干预有效抑制了小鼠肿瘤组织中KDM4C及miR-17-92的表达水平。值得注意的是,由5-FU引起的小鼠全身性不良反应:如体重减轻、肝脏AST及ALT酶活性升高、肠道损伤及粒细胞减少症可以通过AVN A干预有所缓解。综上所述,本研究提取、纯化了AVNs,在体内外评价了AVNs的抗结肠癌活性。通过对AVNs诱导结肠癌发生凋亡的机制的探讨,找到其作用靶点DDX3,并反向垂钓出AVNs中靶向DDX3的活性成分——AVN A。由于AVN A诱导了结肠癌细胞氧化应激且阳性表达γ-H2AX指标,推测其可能对细胞衰老产生影响。进一步研究表明,AVN A通过活化miR-129-3p/Pirh2/p53信号诱导结肠癌细胞衰老,发挥抗结肠癌作用。植物化学成分常应用于临床联合治疗,因此我们又探讨了AVN A与5-FU联合的疗效,结果显示AVN A下调了KDM4C的表达,从而抑制miR-17-92的编码基因——MIR17HG的转录,导致Bim升高,促进结肠癌细胞凋亡。研究发现p53和p21也是miR-17-92的有效靶点,因此AVN A对结肠癌的抑制作用是网络化的,这也体现了小分子多靶点、作用明确等优势。AVN A兼具安全性较好及生物利用度高的特点,本研究可为AVN A深度利用及结肠癌的营养干预提供一定理论依据。