胶质瘤是神经系统最常见的恶性肿瘤,恶性程度高且易复发及局部扩散。目前,其主要治疗方式仍是手术切除,但由于位于中枢神经系统,切除范围有限以致难以彻底清除。因此,需要辅以其他治疗方法,如化疗、放疗、免疫治疗等。目前,对胶质瘤的治疗已取得了一定成果,但由于一些不良反应及胶质瘤耐药的出现,我们有必要寻求毒副作用更小且有效的药物。杨梅黄酮作为一种植物化学物,广泛存在于自然界的植物中,廉价易得,已证实其具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等多重生物学功能。近年来,对其研究主要集中于抗肿瘤方面,表现为对非小细胞肺癌、皮肤癌、食管癌等肿瘤均有一定的治疗作用。因此,本课题将杨梅黄酮用于脑胶质瘤治疗的实验研究以探究其对胶质瘤的治疗作用。本课题分别应用小鼠脑胶质瘤GL261细胞及人神经胶质瘤U251细胞通过体外实验探究杨梅黄酮对胶质瘤细胞的抑制作用。主要从以下三个方面进行研究,分别是杨梅黄酮对GL261细胞与U251细胞增殖及凋亡的影响;杨梅黄酮对胶质瘤细胞迁移及侵袭能力的影响;杨梅黄酮对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外成管能力的影响。为进一步研究杨梅黄酮对胶质瘤的治疗作用及机制奠定实验基础。一、杨梅黄酮对胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响1.杨梅黄酮对胶质瘤细胞活性的影响通过CCK-8实验检测杨梅黄酮对GL261细胞与U251细胞活性的影响。结果显示,对于GL261细胞,杨梅黄酮在浓度为20μM时即可对其活性产生抑制作用,与对照组相比有统计学差异(p<0.01),随浓度升高,抑制作用更明显,并且作用48h表现出比作用24h更强的抑制作用。对于U251细胞,在杨梅黄酮浓度为240μM时对其活性产生抑制作用(p<0.05),随浓度增加,抑制作用更明显,并且作用时间延长(48h)也可增强其对U251细胞活性的抑制作用。说明杨梅黄酮对胶质瘤细胞的活性抑制作用具有剂量-时间依赖性。2.杨梅黄酮对胶质瘤细胞增殖的影响通过流式细胞术检测杨梅黄酮对两种细胞周期的影响。结果显示,杨梅黄酮可增加两种细胞G1期的比例,将细胞周期阻滞于G1期,从而抑制细胞的增殖。进一步通过Western-blot实验检测细胞周期蛋白,结果显示杨梅黄酮可抑制U251细胞周期蛋白Cycline D1的表达。3.杨梅黄酮对胶质瘤细胞的凋亡诱导作用通过Hoechst 33342染色观察杨梅黄酮对GL261细胞与U251细胞的凋亡诱导作用。荧光显微镜下观察可发现杨梅黄酮可使两种胶质瘤细胞凋亡小体出现的比例增加。进一步通过流式细胞术检测杨梅黄酮对GL261细胞与U251细胞凋亡的影响,结果显示,杨梅黄酮可增加两种细胞早期凋亡与晚期凋亡细胞的比例,与相应的对照组相比均有统计学差异(p<0.05),说明杨梅黄酮可诱导胶质瘤细胞的凋亡。二、杨梅黄酮对胶质瘤细胞迁移及侵袭的影响1.杨梅黄酮对GL261细胞与U251细胞迁移的影响利用Transwell实验检测杨梅黄酮对GL261与U251细胞迁移的影响。结果显示,对于GL261细胞,杨梅黄酮浓度在5μM时即表现出对其迁移的抑制作用(p<0.05)。并且随浓度增加,抑制作用更明显。对于U251细胞,在杨梅黄酮浓度为100μM及200μM时,均表现出与平行对照有统计学差异(p<0.001)的对U251细胞迁移的抑制作用。2.杨梅黄酮对GL261细胞与U251细胞侵袭的影响为研究杨梅黄酮对胶质瘤细胞侵袭的影响,我们在Transwell小室底部铺上Matrigel以模仿细胞外基质,然后进行实验。结果显示,杨梅黄酮可减少穿过小室的GL261细胞与U251细胞的数目,与相应的对照相比,细胞数目差异具有统计学意义(p<0.05)。通过逆转录PCR检测杨梅黄酮对胶质瘤细胞MMPs m RNA转录水平的影响,结果显示杨梅黄酮可降低GL261细胞内MMP-2、MMP-9的m RNA水平,也可降低U251细胞内MMP-2、MMP-9以及MMP-14的m RNA水平,与相应的对照组相比有统计学差异(p<0.05)。三、杨梅黄酮对HUVEC体外成管能力的影响利用CCK-8试剂盒检测杨梅黄酮对HUVEC增殖的影响,通过HUVEC的迁移及在Matrigel上成管检测杨梅黄酮对HUVEC成管能力的影响。结果显示,杨梅黄酮可抑制HUVEC的增殖,且具有剂量-时间依赖性。划痕实验显示,同对照组相比,杨梅黄酮可抑制HUVEC的迁移(p<0.001)。在成管实验中,与对照组相比,杨梅黄酮可明显减少诱导形成的小管的长度(p<0.05)。通过以上实验,我们可得出结论,杨梅黄酮可抑制胶质瘤GL261细胞与U251细胞的增殖、诱导其凋亡,同时,也可抑制这两种细胞的迁移及侵袭。杨梅黄酮可作用于人脐静脉内皮细胞,抑制U251细胞诱导的HUVEC体外成管。