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叶绿素(Chl)是光合色素的主要成分,它广泛存在于光合生物体中,在天线系统中捕获光能,并驱动电子转移到反应中心。在高等植物中有Chl a和Chl b二种叶绿素,光合反应中心仅含Chla,外围光捕获天线复合物则含有Chl a和Chl b。叶绿素生物合成从谷氨酰-tRNA到Chl a,再到Chl b,整个生物合成过程需要15步反应。目前,在以拟南芥(Arabidopsis thaliana)为代表的被子植物中,控制叶绿素生物合成所有15步反应的酶基因都已成功克隆。拟南芥全基因组分析表明,其叶绿素生物合成从谷氨酰-tRNA到Chl b需要15种酶,编码这些酶的基因有27个。然而,水稻{Oryza sativa)中迄今只克隆了编码参与叶绿素生物合成的3个酶的6个基因,它们是编码Mg-螯合酶三个亚基的OsChlH, OsChlD和OsChll基因,编码叶绿素合酶的YGL1基因,以及编码叶绿素酸酯a加氧酶的OsCAO1和OsCAO2基因。有氧光合生物的叶绿素,根据乙烯侧链的数目,可以分为3,8-联乙烯叶绿素(DV-Chl)和3-乙烯叶绿素即单乙烯叶绿素(MV-Chl)二类。几乎所有的有氧光合生物,尽管他们固有的生存环境不同,但在正常生长情况下都只含有MV-Chl。3,8-联乙烯(原)叶绿素(酸酯)a8-乙烯还原酶(DVR)将四吡咯上的8-乙烯基还原为乙基,这对于MV-Chl的生物合成是必不可少的。迄今,已分别从拟南芥、绿硫细菌(Chlorobium tepidum)和胞藻{Synechocystis sp. PCC6803)中克隆了3个联乙烯还原酶基因(DVR,bciA和slr1923),酶学分析证实重组DVR和BciA蛋白分别能催化联乙烯叶绿素酸酯(DV-Chlide)a和联乙烯原叶绿素酸酯(DV-Pchlide)a转化为相应的MV-型物质。然而,单子叶植物中还没有克隆该酶基因的报导。本研究从籼稻824B中分离出的一个自然黄化突变体824ys,该突变体在整个生长发育期表现黄绿叶,植株生长非常缓慢,尽管它的抽穗期比野生型亲本延迟16天,但株高和有效分蘖数分别减少25.6%和64.9%。叶片色素含量测定结果显示,824ys突变体的Chl a、Chl b和总叶绿素含量分别只有野生型亲本的41-48%、9～22%和33-42%,表明该突变体表型是由叶绿素含量降低引起的。运用透射电子显微镜观察叶绿体形态和发育,结果显示,与野生型亲本相比较,824ys突变体叶肉细胞和叶绿体的形状均不规则,叶绿体数目减少,叶绿体的类囊体膜发生退化,排列较混乱,基粒垛叠较少,表明该突变体中叶绿体的发育受到抑制。遗传分析表明824ys黄绿叶突变性状由1对隐性核基因控制,该突变基因初步定位在水稻第3染色体短臂,与SSR标记RM282相距5.2cM。运用824ys突变体与粳稻品种02428杂交F2代作为定位群体,进一步将824ys突变位点定位于2个InDel标记PR809和PR826之间,遗传距离分别为0.2 cM和0.4 cM,这2个标记将突变基因界定在一个142 kb长的区域内。在该区域发现一个开放阅读框(ORF) Os03g22780编码假定的异黄酮还原酶,序列BLASTX比对显示它的蛋白质产物与拟南芥联乙烯还原酶(DVR)有65%的同源性。于是,分别从野生型和824ys突变体中克隆了这个Os03g22780基因,DNA测序结果显示824ys突变体中该ORF在第952-960位缺失9个核苷酸,从而导致其蛋白质产物缺失3个氨基酸(Lys, Val和Pro)。因此,认为Os03g22780基因是824ys突变位点的候选基因,暂命名为OsDVR基因。水稻基因组数据库BLAST搜索结果显示OsDVR是一个单拷贝基因,ORF长1218 bp,编码一个含405氨基酸的蛋白质,该蛋白质分子量约43 kDo OsDVR蛋白质在其N-端含有一个由58个氨基酸组成的明显的叶绿体靶序列。利用高效液相色谱(HPLC)检测了824ys突变体的叶绿素组成成分,结果显示该突变体所含叶绿素是DV-Chl,它没有MV-Chl,表明该突变体含有一个有缺陷的联乙烯还原酶(DVR),因此,我们确信824ys突变位点的候选基因就是OsDVR。为了检测OsDVR重组蛋白能否表现出DVR酶活性,在大肠杆菌中表达野生型OsDVR和突变型Osdvr重组蛋白,用NADPH作为还原剂,4种四吡咯物质(DV-Chl a、-Chl b、-Chlide a和-Chlide b)作为反应底物。结果表明该重组蛋白不仅能将DV-Chlide a转化为MV-Chlide a,而且能将DV-Chl a转化为MV-Chl a,因此,证实了OsDVR (Os03g22780)编码有功能的水稻联乙烯还原酶,824ys突变体中3个氨基酸(Lys,Val和Pro)的缺失导致OsDVR酶活性的丧失。综上所述,本研究首次从单子叶植物中成功克隆了联乙烯还原酶基因,而且更重要的是,证实了一种新的联乙烯还原酶活性,即催化联乙烯叶绿素a转化为单乙烯叶绿素a,这对进一步阐明叶绿素的生物合成途径具有重要意义,并为该酶及其编码基因的开发利用奠定基础。