背景烫伤是由物理、化学等因素造成的皮肤损伤性疾病,也是生活中经常遇到的外伤之一。不同于普通外伤,烫伤存在创面疼痛、组织坏死、易并发感染、愈合后创面易留疤痕等难题。烫伤首先破坏皮肤屏障,而皮肤功能的丧失可引发一系列的应激反应,产生全身性病理生理、代谢、免疫等复杂变化,从而引起一系列并发症,比如脓毒血症、全身炎症反应综合症、多器官功能障碍综合症等。临床常用西药、中药、中西药联合治疗,但疗效并不理想,创面易反复感染、破溃,令患者苦不堪言,预后也容易形成疤痕,影响美观。因此,开发新型抗烫伤药物,迫在眉睫。蝇蛆,中医学称为五谷虫,是丽蝇科,丝光绿蝇、大头金蝇或其它近缘昆虫的幼虫,多部中医古籍中均有其用于治疗感染性外科疾病的记载。临床研究表明蝇蛆疗法在清创过程中对正常组织无损伤且同时发挥抗感染、促愈合的作用。从蝇蛆中分离的活性成分蝇蛆蛋白,除具有抗菌活性外还具有抗病毒、提高免疫力、清除氧自由基、减缓衰老、抗癌等多种作用,但蝇蛆蛋白对皮肤烫伤的治疗作用及其制剂研究目前少有报道。因此,将蝇蛆蛋白开发成安全、有效的制剂,对于治疗皮肤烫伤具有重要意义。目的1.分离提取蝇蛆中的蛋白质成分,并进行初步的药效学评价;2.制备蝇蛆蛋白凝胶;3.建立蝇蛆蛋白凝胶的质量标准;4.研究蝇蛆蛋白凝胶治疗大鼠烫伤的药效学作用。方法1.蝇蛆蛋白的提取及初步药效学评价:采用无菌饲料对丝光绿蝇虫卵进行人工饲养,采用虫卵、虫体“双重消毒法”,获得无菌蝇蛆,并做细菌和病毒学检查。采用研磨、加热、离心等方法制备蝇蛆蛋白。用热水在大鼠背部造成深Ⅱ度烫伤模型,每个创面给予0.2g蝇蛆蛋白,每日换药1次,连续用药14天。观察创面的愈合情况,记录愈合率和愈合时间,测定创面组织内羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量。在明确药效的基础上,对蝇蛆蛋白进行分离,具体方法为根据蝇蛆蛋白在280nm处的吸收情况,用交联葡聚糖G-50柱分离蝇蛆蛋白内的不同片段,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)法检测各组份分子量范围。测定P6组份的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),以P6的MIC为标准测定P1-P7的体外抑菌活性。最后,评价P1-P7对创面愈合情况及HYP含量的影响。2.蝇蛆蛋白凝胶的制备:综合考察了凝胶常用基质卡波姆-940、羧甲基纤维素钠(carboxymethylcellulose sodium,CMC)、高取代羟丙基纤维素(hydroxypropyl cellulose,H-HPC)、羟丙基甲基纤维素(hydroxypropyl methyl cellulose,HPMC)和蝇蛆蛋白提取物混合后的性状,并初步确定蝇蛆蛋白处方。制定凝胶筛选评分标准,对蝇蛆蛋白凝胶进行评分。通过单因素实验和正交设计实验,以卡波姆-940、丙二醇的用量及pH为考察因素,考察各因素对凝胶剂稳定性的影响。最后,按照正交实验所得凝胶剂最佳处方和工艺,用评分标准对3份凝胶进行综合评分,确定处方。3.蝇蛆蛋白凝胶质量标准建立:根据2010版《中国药典》的有关规定,分别测定了三个批次蝇蛆蛋白凝胶的外观性状、pH值、粒度、无菌、装量差异、蛋白含量等项目,根据实验结果,制定了相关质量标准。另外,分别测定蝇蛆蛋白凝胶在离心、高寒和高热环境下的稳定性。4.蝇蛆蛋白凝胶的药效学研究:在大鼠背部用热水造成深Ⅱ度烫伤模型,给予蝇蛆蛋白凝胶(0.2g/创面),治疗14天,观察并记录各组创面变化情况,将大鼠处死后收集血液、创面组织。观察创面组织病理学变化,用试剂盒测定样本中HYP、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)等指标的含量和水平,用免疫组化法测定创面表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的表达。结果1.蝇蛆蛋白的提取及初步药效学评价:细菌和病毒学检测结果显示虫卵虫体双重消毒法处理的蝇蛆未见细菌病毒感染,可以进一步应用。烫伤大鼠创面给予蝇蛆蛋白治疗后,可明显缩短创面愈合时间,提高愈合率,促进创面HYP的生成。根据蝇蛆蛋白不同紫外吸收特征峰,从中分离出7个组份(P1-P7),在相同条件下,P6组对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的MIC均为50mg/ml,抑菌环直径显著大于对照组和其他组份,而且在提高烫伤创面HYP含量方面,活性也明显优于其他组份。因此,将蝇蛆蛋白P6组份应用于下一步实验。2.蝇蛆蛋白凝胶的制备:通过考察不同基质和蝇蛆蛋白提取物混合后的性状,选择卡波姆-940作为凝胶剂基质。根据MIC实验结果,确定处方中蝇蛆蛋白P6组份的剂量为5g。根据单因素实验和正交设计实验确定凝胶剂最佳处方,取P6 5.0g、卡波姆-940 0.6g、丙二醇10.0g、吐温-80 0.2g、羟苯乙酯0.1g按工艺制备凝胶,通过调节三乙醇胺的用量将凝胶的pH值调整为6.5,验证实验结果表明凝胶稳定。3.蝇蛆蛋白凝胶质量标准建立:将pH值控制在6.50-6.65之间,粒度控制在180μm以内,不得检出细菌,将标示装量暂定为20g。建立蝇蛆蛋白凝胶中蛋白含量的测定方法,考察线性关系,相关系数r=0.9990,表明蛋白质量浓度在40.4~404.0μg/mL范围内,吸光度与质量浓度呈良好的线性关系;6次测定的吸光度RSD值小于2%,说明仪器精密度良好;30min内,7次吸光度值的RSD值小于2%,表明溶液在30min内稳定性好;将吸光度测定结果带入线性方程,求出6份供试品溶液蛋白含量,通过计算,RSD值小于2%,说明方法重复性好;将吸光度测定结果带入线性方程,求得9份供试溶液的蛋白含量,由测得量和加入量计算得加样回收率为99.56%(RSD<2%),符合98%-102%的要求。最终,根据测定结果确定蝇蛆蛋白凝胶中的蛋白含量应在4.41%-4.87%之间。稳定性考察结果表明,蝇蛆蛋白凝胶在离心、高寒和高热环境下,性状均稳定。4.蝇蛆蛋白凝胶的药效学研究:创面给予蝇蛆蛋白凝胶,通过形态学观察发现,蝇蛆蛋白凝胶在创伤早期就可以减轻炎症反应,加速结痂过程,还可显著缩短创面愈合时间,提高创面愈合率。病理学检查结果提示,蝇蛆蛋白凝胶组创面皮肤附属器和新生上皮组织覆盖较模型组明显加快,且可见大量新生毛细血管和成纤维细胞生成,胶原排列整齐,粒细胞浸润明显较少。蝇蛆蛋白凝胶还可显著提高创面组织中HYP含量,增加EGF、bFGF表达和SOD活力,降低MDA含量,减少TNF-α和IL-6表达。结论蝇蛆蛋白具有良好的抗感染、促愈合作用,对从蝇蛆蛋白中分离获得的7个主要组份进行活性筛选,获得活性最强的蛋白组份P6;以该组份为主药制备的蝇蛆蛋白凝胶性质稳定、质量可控,且对大鼠烫伤具有良好的治疗作用,其机制可能与其促进创面胶原合成,抗炎和抗氧化作用有关。通过本课题的研究,对蝇蛆蛋白及其凝胶治疗烫伤的整体药效有了更深入的认识,为未来的药物开发及进一步的机制研究奠定了坚实的实验基础。