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上皮性卵巢癌(Epithelial Ovarian Cancer,EOC)是女性常见的生殖系统恶性肿瘤,患者五年生存率仅为1 5%-30%。由于卵巢癌起病隐匿,且目前尚无敏感而可靠的早期诊断方法,使大部分患者就诊时肿瘤已经发展到晚期。因此,深入研究卵巢癌的发病机制,寻找并选择有效的治疗方案,是提高卵巢癌生存率、改善患者预后的关键。近年来随着对肿瘤代谢研究的深入,越来越多的证据支持代谢是肿瘤发生过程中的一个核心问题,代谢重编程成为遗传事件介导恶性转化不可或缺的途径。丙酮酸激酶M2亚型(Pyruvate Kinase Isotype M2,PKM2)是葡萄糖酵解链中的重要限速酶,PKM2在Warburg效应和肿瘤增殖中的重要地位使PKM2成为科学家们研究的焦点,但PKM2在卵巢癌中的表达模式及作用机制尚不清楚。本课题拟从三个方面进行研究:(1)检测不同卵巢癌细胞株及组织标本中PKM2的表达,并探讨其与临床病理参数的相关性;(2)通过下调PKM2的表达,检测其对卵巢癌细胞糖代谢以及增殖、转移能力的影响;(3)探讨FSH对PKM2的调控以及对PKM2介导的卵巢癌葡萄糖代谢异常和增殖能力的影响。第一部分PKM2在卵巢癌中的表达目的:检测不同卵巢癌细胞株及卵巢癌组织标本中PKM2的表达,并分析其与临床病理参数的关系。方法:利用Real-time PCR及Western blot的方法检测卵巢癌细胞株C200、Caov3、SKOV3、HO8910、OVCAR3中PKM2 mRNA及蛋白的表达水平;使用免疫组织化学方法检测60例上皮性卵巢癌组织和正常卵巢组织中PKM2基因的表达差异,并应用半定量分析PKM2的表达与卵巢癌临床病理参数的关系。结果:组织中表达:PKM2在正常卵巢组织和恶性上皮性卵巢肿瘤中的表达水平有显著性差异,免疫组化评分显示PKM2在上皮性卵巢癌里表达增强(P<0.01)。但PKM2在浆液性卵巢癌中的表达和在其他类型上皮性卵巢癌中的表达并无显著性差异(P=0.81)。与病理参数相关:在浆液性卵巢癌标本中,PKM2的表达与细胞分化程度、肿瘤大小正相关(P<0.01,P<0.05)。细胞系中表达:PKM2在人卵巢癌细胞株中高表达。在SKOV3和OVCAR3细胞中,PKM2的mRNA及蛋白的表达显著。结论:PKM2在卵巢癌细胞及组织中高表达,且与肿瘤与细胞分化程度、肿瘤大小正相关,提示PKM2可能促进卵巢癌的恶性进展。第二部分 PKM2对卵巢癌细胞生物学行为的影响目的:探索PKM2对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响。方法:构建PKM2干扰的慢病毒转染SKOV3和OVCAR3细胞,应用CCK-8检测、Transwell小室迁移、流式检测PKM2慢病毒干扰后对SKOV3和OVCAR3增殖、迁移、侵袭以及细胞周期及凋亡的影响;Real-time PCR和Western blot方法检测PKM2慢病毒干扰后SKOV3和OVCAR3细胞E-cadherin、MMP2、MMP9、Bad、HIF1α、Caspase7、VEGF 指标的改变。结果:PKM2慢病毒干扰后SKOV3和OVCAR3细胞中PKM2干扰效果明显,Real-time PCR结果显示SKOV3和OVCAR3细胞中PKM2基因干扰效率分别为75.9%和 75.8%,效果显著(P<0.001)。PKM2 干扰后对 SKOV3 和 OVCAR3细胞的增殖起到抑制作用(P<0.01)。下调PKM2的表达使细胞迁移能力在SKOV3及OVCAR3中分别下降57%(P<0.01)及51%(P<0.01)。侵袭实验中,PKM2表达下降使穿过小室的细胞数分别下降58%(P<0.001)及66%(P<0.001)。细胞周期结果发现,SKOV3和OVCAR3细胞中siRNA-PKM2干扰组的细胞发生 G0-G1 期阻滞。下调 PKM2 后,SKOV3 和 OVCAR3 细胞中 E-cadherin、Bad、Caspase7 表达升高,MMP2、MMP9、HIF1α、VEGF 表达降低。结论:PKM2可以调控卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭及细胞凋亡,PKM2慢病毒干扰SKOV3和OVCAR3细胞后,会引起肿瘤相关基因的表达发生改变。第三部分FSH通过PKM2对卵巢癌细胞葡萄糖代谢和增殖的调控目的:探讨下调PKM2对FSH诱导的卵巢癌细胞增殖以及葡萄糖代谢的影响。方法:构建PKM2干扰的慢病毒转染SKOV3和OVCAR3细胞,应用葡萄糖、乳酸测定的方法研究PKM2表达干扰后对卵巢癌细胞糖代谢的影响。Reatime-PCR和Western blot方法检测SKOV3和OVCAR3细胞在不同浓度FSH作用下PKM2的表达,并测定相应的细胞葡萄糖和乳酸的浓度改变。利用CCK-8检测PKM2表达干扰后FSH对SKOV3和OVCAR3细胞的促增殖作用的改变。结果:1.PKM2干扰后显著降低卵巢癌细胞的细胞葡萄糖消耗和乳酸生成(P<0.01)。2.FSH能在RNA和蛋白水平显著上调PKM2的表达,并增加卵巢癌细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成。3.FSH有促进卵巢癌增殖的作用,当进一步敲低PKM2表达后,FSH这种促细胞增殖的作用减弱,代谢上出现葡萄糖消耗减少和乳酸生成减少。结论:PKM2干扰后可抑制卵巢癌细胞的有氧糖酵解,FSH能诱导PKM2表达上调,并有促进卵巢癌有氧糖酵解作用,而FSH对卵巢癌细胞的促增殖作用能受到PKM2调控。