研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease,CAD)已成为临床最常见的心脏疾病。动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)则是冠心病最基本的的病理生理学基础,但目前AS的发病机理仍未完全明确。目前公认的脂质沉积、氧化修饰和炎症反应均是动脉粥样硬化斑块形成的基本病理特征。因此血脂代谢异常是其最重要的危险因素之一,经过氧化修饰后的低密度脂蛋白(Oxdized low-density lipoprotein, Ox-LDL)则极易损伤内皮功能、促进胆固醇的内皮下沉积和激活巨噬细胞迁移与吞噬,最终形成泡沫细胞并激活进一步的炎症反应,加速AS的演变。因此Ox-LDL和巨噬细胞在AS病变早期,无论在炎症激活和脂质代谢方面均发挥有重要作用。单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)属于趋化因子(chemotactic cytokines, C-C)亚族的主要成员之一。斑块结构内的主要组成细胞,包括单核／巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞等在多种炎症刺激下均可被诱导分泌MCP-1,进一步诱导单核／巨噬细胞迁移至血管内皮下吞噬脂质,形成泡沫细胞,从而加速AS的进展。因此,MCP-1在AS的发生发展中扮演着重要角色,提示MCP-1可能为动脉粥样硬化的重要治疗靶点之一。逆胆固醇转运(reverse cholesterol transport, RCT),即是指机体将胆固醇从周围组织(包括动脉粥样硬化斑块)转运到肝脏进行再循环或以胆酸的形式排泄的这一整个过程,它包括了主要在肝脏进行的胆固醇清除和在外周组织进行的胆固醇外流(cholesterol efflux)两个主要环节。参与外周组织胆固醇外流的转运蛋白如ATP结合盒转运蛋白A1(ATP-binding cassette transport protein A1, ABCA1)ABCA1、ATP结合盒转运蛋白Gl (ATP-binding cassette transport protein G1,ABCG1)和清道夫受体-B族Ⅰ型(Scavenger receptor class B type I, SR-BI)等,均存在于巨噬细胞膜表面,参与了巨噬细胞中将脂质从细胞内移至细胞外并与高密度脂蛋白(High-density lipoprotein, HDL)结合的过程,从而对胆固醇外流进行调节。因此,如何改善胆固醇转运蛋白所介导的逆胆固醇转运,同样是目前防治AS的一项研究热点。姜黄素是一种从生姜中提取的活性药物单体,已经有诸多研究证实姜黄素表现出抗炎、抗氧化、抑制肿瘤和调节能量代谢等多种生物活性,广泛涉及到细胞增殖、炎症、凋亡等多种信号通路调节机制。另外有研究发现姜黄素可以抑制炎症介质分泌、升高动物体内HDL-C水平以及促进脂质代谢等抗AS和心血管保护作用,但其中许多具体机制仍有待研究。研究目的分别以小鼠源性的Raw264.7巨噬细胞和人源性的THP-1细胞作为研究对象,运用分子生物学技术,如酶联免疫吸附实验(ELISA)、蛋白免疫印迹实验(Western blot)、放射性同位素标记等方法,观察姜黄素对Ox-LDL刺激下巨噬细胞分泌MCP-1和逆胆固醇转运的影响,并探讨其可能的相关机制,进一步揭示姜黄素在心血管药理学方面的分子机制,为姜黄素在心血管疾病治疗上的应用提供理论依据。研究方法第一部分姜黄素对Ox-LDL诱导巨噬细胞MCP-1分泌的影响及相关信号通路的研究1、药物毒性试验实验分组：1)正常对照组,2)姜黄素5μM组,3)姜黄素10μM组,4)姜黄素20μM组,5)姜黄素40μM组,6)姜黄素80μM组；按分组给予刺激后,于细胞培养箱中干预24h,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测细胞生存活性,目的是排除在实验范围内引起细胞因子分泌水平减少是由于药物引起细胞数量减少所致的可能性,同时寻找合适的药物刺激浓度范围。2、Ox-LDL对Raw264.7巨噬细胞及THP-1巨噬细胞MCP-1分泌的影响1、浓度效应：实验分组：1)正常对照组,2) Ox-LDL (10μg/ml)组,3)Ox-LDL (20μg/ml)组,4) Ox-LDL (40μg/ml)组,5) Ox-LDL (80μg/ml)组,干预24h；2、时间效应：实验分组：1)0h对照组,2)6h刺激组,3)12h刺激组,4)24h刺激组,均以80μg/ml Ox-LDL干预：通过ELISA方法检测细胞培养基中MCP-1的浓度。3、姜黄素对Ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞及THP-1巨噬细胞MCP-1分泌的影响实验分组：1)正常对照组,2) Ox-LDL (80μg/ml)组,3) Ox-LDL (80μg/ml)+姜黄素(5μM)组,4) Ox-LDL (80μg/ml)+姜黄素(10μM)组,5)Ox-LDL (80μg/ml)＋姜黄素(20μM)组,6) Ox-LDL (80μg/ml)+姜黄素(40μM)组。通过ELISA方法检测细胞培养基中MCP-1浓度。4、不同促分裂原活化蛋白激酶MAPK (Mitogen activated protein kinase, MAPK)信号通路(p38MAPK, JNK,ERK1/2)抑制剂及核转录因子-κB(NF-κB)通路抑制剂对Ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞MCP-1分泌的影响实验分组：1)正常对照组,2) Ox-LDL (80μg/ml)组,2) Ox-LDL (80μg/ml)+SB203580(p38抑制剂)组,3) Ox-LDL (80μg/ml)+SP600125(JNK抑制剂)组,4)Ox-LDL (80μg/ml)+PD98059(ERK1/2抑制剂)组,5) Ox-LDL (80μg/ml)+BAY11-7082(NF-κB抑制剂)组。通过ELISA方法对Raw264.7细胞培养基MCP-1进行检测,通过此实验确定OxLDL诱导细胞分泌MCP-1可能被介导的信号通路,为下一步实验提供参考。5、JNK抑制剂(SP600125)对Ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞JNK磷酸化的影响实验分组：1)正常对照组,2) Ox-LDL (80μg/ml)组,3) Ox-LDL (80μg/ml)+SP600126组。通过Western blot检测JNK通路磷酸化水平。6.NF-κB抑制剂(BAY11-7082)对Ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞核内NF-κBp65表达的影响实验分组：1)正常对照组,2) Ox-LDL (80μg/ml)组,3) Ox-LDL (80μg/ml)+BAY11-7082组。提取核蛋白,通过Western blot检测核内NF-κB p65蛋白水平。7、姜黄素对Ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞JNK磷酸化和核内NF-κB p65的影响实验分组：1)正常对照组,2) Ox-LDL (80μg/ml)组,3) Ox-LDL (80μg/ml)+姜黄素(5μM)组,4) Ox-LDL (80μg/ml)+姜黄素(10μM)组,5) Ox-LDL (80μg/ml)＋姜黄素,6) Ox-LDL (80μg/ml)+姜黄素(40μM)。分别提取细胞蛋白及核蛋白,通过Western blot检测JNK通路磷酸化和核内NF-κB p65蛋白水平。第二部分姜黄素对Ox-LDL诱导下巨噬细胞逆胆固醇转运的影响及相关机制探讨1、姜黄素对Ox-LDL诱导下Raw264.7细胞及THP-1巨噬细胞中胆固醇流出率的影响实验分组：1)对照组,2)姜黄素(5μM)组,3)姜黄素(10μM)组,4)姜黄素(20μM)组,5)姜黄素(40μM)组；通过放射性同位素标记法来检测各组样品的胆固醇流出率。2、姜黄素对Ox-LDL诱导下Raw264.7巨噬细胞胆固醇转运相关蛋白表达的影响实验分组:1)对照组,2)姜黄素(5μM)组,3)姜黄素(10μM)组,4)姜黄素(20μM)组,5)姜黄素(40μM)组；提取蛋白,通过Western blot检测脂质转运相关蛋白表达情况。3. MAPK通路抑制剂及NF-κB抑制剂对Ox-LDL诱导下Raw264.7巨噬细胞胆固醇流出率的影响实验分组:1)对照组,2)SB203580(p38抑制剂)组,3)SP600125(JNK抑制剂)组,4)PD98059(ERK1/2抑制剂)组,5) BAY11-7082(NF-κB抑制剂)组；通过放射性同位素标记法来检测细胞样品的胆固醇流出率。4、JNK抑制剂对Ox-LDL诱导下Raw264.7巨噬细胞胆固醇转运相关蛋白表达的影响实验分组：1)对照组,2)SP600125(10μM)组,3) SP600125(20μM)组；按分组行不同刺激后,提取细胞蛋白,通过Western blot检测脂质转运相关蛋白表达情况。研究结果第一部分姜黄素对Ox-LDL诱导巨噬细胞MCP-1分泌的影响及相关信号通路的研究1、姜黄素在0-80μM浓度范围内对巨噬细胞生存活性的影响用不同浓度姜黄素(0,5,10,20,40,80μM)刺激Raw264.7细胞及THP-1巨噬细胞后,各组之间行整体比较,组间生存活性呈显著性差异(F=56.651,P<0.001)(F=17.911,P<0.001)。进一步做组间两两比较发现,80μM刺激浓度下细胞数目急剧下降,对细胞产生明显毒性作用；而0-40μM浓度范围的姜黄素分别对Raw264.7细胞及THP-1巨噬细胞的生存活性均无明显影响。因此此实验提供了姜黄素合适的实验浓度范围参考(0-40μM),排除了在后续实验中引起的细胞因子分泌水平减少是由于药物毒性作用引起细胞数量减少或活性降低所致的可能干扰因素。2、Ox-LDL可诱导巨噬细胞分泌MCP-1,在本实验的浓度范围内分别呈浓度依赖性和时间依赖性不同浓度(0,10,20,40,80μg/ml) Ox-LDL作用于Raw264.7细胞及THP-1巨噬细胞后,细胞培养基中MCP-1的分泌有不同程度的增加(F=58.69,P<0.001)(F=86.98,P<0.001),并呈浓度依赖性。与对照组比较,此实验中Ox-LDL刺激效应在80μg/ml浓度时达到最高,故此以后实验均采用80μg/ml浓度进行细胞干预。将80μg/ml浓度的Ox-LDL作用于Raw264.7细胞及THP-1巨噬细胞不同时间点(0、6、12、24h)后,检测得细胞培养基中的MCP-1均有不同程度的增加(F=99.80, P<0.001)(F=68.62, P<0.001),并呈现时间依赖性。此实验中MCP-1分泌在24h达到最高,故此以后实验中用Ox-LDL干预细胞时间均设为24h。3、姜黄素可抑制Ox-LDL诱导巨噬细胞MCP-1分泌先加入不同浓度(0,5,10,20,40μM)的姜黄素预处理细胞1h,再给予80μg/ml浓度的Ox-LDL刺激24h后,检测培养基中MCP-1浓度。两种细胞系所得结果相一致,结果显示不同组间具有显著性差异(F=75.96,P<0.001)(F=71.39,P<0.001)。与阴性对照组相比,其余各组细胞培养基中MCP-1均明显偏高。而与Ox-LDL单独刺激组比较,Ox-LDL+姜黄素(10μM)、Ox-LDL+姜黄素(20μM)组和Ox-LDL+姜黄素(40μM)组细胞培养基中MCP-1水平明显减低,具有显著性差异,并且总体呈剂量依赖性。而两组细胞系中Ox-LDL+姜黄素(5gM)组和Ox-LDL单独刺激组比较,无显著性差异(P=0.090)(P=0.769)4、JNK通路和NF-κB通路介导了Ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞分泌MCP-1将不同的MAPK信号通路(p38MAPK、JNK、ERK1/2)抑制剂(SB203580、SP600125、PD98059)以及NF-κB通路抑制剂(BAY11-7082)分别预处理细胞1h,再给予Ox-LDL (80μg/ml)刺激24h。与对照组相比,Ox-LDL单独刺激组细胞培养基中的MCP-1明显升高(802.44±83.86pg/ml),具有显著性差异(P<0.001)。与Ox-LDL单独刺激组相比,Ox-LDL+SP组及Ox-LDL+BAY组细胞培养基中的MCP-1分别明显降低(576.20±41.82pg/ml)(P<0.001)(658.34±63.28pg/ml)(P<0.001),差异具有统计学意义；但是,Ox-LDL+SB组和Ox-LDL+PD组与Ox-LDL组无统计学差异(P=0.301和P=0.404),通过此实验发现了MCP-1分泌可能被JNK信号通路及NF-κB通路所介导,为下一步实验提供参考。5、Ox-LDL促进Raw264.7巨噬细胞JNK磷酸化而JNK抑制剂(SP600125)可有效的抑制该通路激活根据上一个实验结果,我们给予JNK抑制剂(SP600125)预处理细胞1h,再给与Ox-LDL(80μg/ml)组刺激30main。与对照组比较,Ox-LDL刺激组JNK磷酸化水平明显增加(P=0.003)；而与Ox-LDL组比较,Ox-LDL+SP组中的细胞磷酸化JNK的水平则出现明显降低(P=0.028),组间比较均具有显著性差异。6、Ox-LDL增加Raw264.7巨噬细胞核内NF-κB p65蛋白水平而NF-κB抑制剂(BAYll-7082)可有效的抑制该通路激活与上一步相似,我们给予NF-κB通路抑制剂(BAY11-7082)预处理细胞1h,再给与Ox-LDL (80μg/ml)组刺激30min。与对照组比较,Ox-LDL刺激组核内NF-κB p65水平明显增加(P=0.002)；而与Ox-LDL组比较,Ox-LDL+BAY组中的细胞核内的NF-κB p65水平则出现明显降低(P=0.032),组间比较均具有显著性差异。7、姜黄素可抑制Ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞JNK磷酸化及核内NF-κBp65表达给予不同浓度姜黄素(0-40μM)预处理后,再给予Ox-LDL (80μg/ml)刺激30main。与对照组比较,Ox-LDL刺激组磷酸化JNK表达水平明显升高(P<0.01),差异具有显著性；与Ox-LDL刺激组比较,姜黄素(10、20、40μM)+Ox-LDL组均可明显下调JNK磷酸化水平(P=0.004、P<0.001、P<0.001),具有显著性差异。与抑制JNK激活效应相类似的,与对照组比较,Ox-LDL刺激组核内NF-κBp65表达水平明显上升,而姜黄素(20、40μM)+Ox-LDL组均可明显下调核内NF-κB p65水平(P<0.001、P<0.001),具有显著性差异。两组实验总体效应均呈剂量依赖性。而两组实验中Ox-LDL刺激组与姜黄素(5、10mM)+Ox-LDL组比较均未见统计学差异(P=0.491,P=0.060)。综上实验结果提示:姜黄素可以通过抑制JNK通路及NF-κB通路的激活,降低Ox-LDL诱导的巨噬细胞MCP-1分泌。第二部分姜黄素对巨噬细胞逆胆固醇转运的影响及其相关机制研究1、姜黄素可增强Ox-LDL诱导下巨噬细胞的胆固醇流出率将不同浓度(0,5,10,20,40μM)的姜黄素刺激Raw264.7细胞后,与对照组胆固醇流出率(5.60±0.61%)相比,姜黄素10、20和40μM刺激组胆固醇流出率明显上升(分别为6.95±0.67%,9.15±0.68%和10.68±0.79%)(P=0.016、P<0.001和P<0.001),且在实验浓度范围内成剂量依赖性。而对照组与5μM刺激组(5.90±0.76%)之间比较则无显著性差异。与上述结果相类似,在不同浓度姜黄素刺激THP-1巨噬细胞后,与对照组流出率(7.39±1.25%)相比,姜黄素10、20和40μM刺激组胆固醇流出率也呈逐渐上升趋势(分别为11.77±1.84%,14.43±2.11%和15.67±1.71%)(P=0.002、P<0.001和P<0.001),结果均有显著性差异。而对照组与5μM刺激组(7.89±1.49%)之间比较则无显著性差异。2、姜黄素可上调Ox-LDL诱导下Raw264.7巨噬细胞的胆固醇代谢相关蛋白(ABCAl、SR-BI、LXRα)的表达上一步的实验结果已经证实姜黄素对逆胆固醇转运功能的影响,因此在本实验中我们着重观察姜黄素对胆固醇转运蛋白表达的调节机制：给予不同浓度(0,5,10,20,40gM)姜黄素处理细胞后,ABCA1、SR-BI、和LXRa三个蛋白表达指标的组间差异均十分显著(F=27.604,P<0.001；F=48.577,P<0.001；F=33.054,P<0.001),而ABCG1组间差异无统计学意义(F=0.693,P=0.614)与对照组比较,姜黄素(10μM、20μM与40μM)明显提高了ABCA1、SR-BI及LXRa三个蛋白的表达水平,且在实验浓度范围内呈剂量依赖效应,差异均具有统计学意义。以上实验结果提示:姜黄素可上调胆固醇代谢蛋白的表达来增强逆胆固醇转运功能。3、JNK抑制剂可增强Ox-LDL诱导下Raw264.7巨噬细胞的胆固醇流出率为了进一步观察上一部分实验中讨论的MAPK及NF-κB信号通路是否参与了姜黄素增强细胞中逆胆固醇转运的效应,我们分别加入不同的通路抑制剂处理细胞。与对照组比较,JNK抑制剂(SP600125)组胆固醇流出率明显升高(5.35±0.59%vs.7.88±0.67%),具有显著性差异(P<0.001)。而与对照组比较,p38抑制剂(SB203580)组、ERK抑制剂(PD98059)组和NF-κB抑制剂(BAY11-7082)组胆固醇流出率未见明显变化,差异不具有统计学意义(P=0.819,P=0.612,P=0.900)。本部分实验结果提示JNK通路可能介导了胆固醇转运的调节。4、JNK抑制剂可上调Ox-LDL诱导下Raw264.7巨噬细胞的ABCA1、SR-BI蛋白表达,但对LXRa蛋白表达无影响为进一步证实JNK通路介导了胆固醇逆转运变化,用不同浓度JNK抑制剂刺激Raw264.7巨噬细胞。Western Blot结果显示：JNK抑制剂可以显著上调ABCA1和SR-BI的表达,具有显著性差异(F=18.034,P=0.003；以及F=16.469,P=0.004)；但对细胞核蛋白LXRa的调节则未见明显影响,无显著性差异(F=0.352,P=0.717)。前面的实验结果已经证实,姜黄素具有JNK抑制剂样作用,可抑制JNK通路的磷酸化激活,结合本部分3、4结果,提示姜黄素可通过抑制JNK磷酸化途径调节逆胆固醇转运蛋白(ABCA1与SR-BI)的表达和胆固醇流出率,并且可能与姜黄素上调LXRa表达的通路调节效应相互独立。结论1)姜黄素在(0-40μM)浓度范围内无细胞毒性；2)Ox-LDL诱导巨噬细胞MCP-1分泌,并呈浓度依赖效应和时间依赖效应；3)JNK通路和NF-κB通路介导了Ox-LDL诱导下的巨噬细胞MCP-1分泌；4)姜黄素分别通过抑制JNK通路磷酸化和抑制NF-κB通路激活,减少Ox-LDL诱导的巨噬细胞分泌MCP-1；5)姜黄素可以上调巨噬细胞细胞内LXRa-ABCA1/SR-BI这一经典通路的表达,进而增强细胞内的胆固醇流出率；6)姜黄素可以抑制Ox-LDL诱导下的JNK磷酸化途径,增强Ox-LDL诱导的巨噬细胞中胆固醇膜转运蛋白(ABCA1/SR-BI)的表达和胆固醇流出率,且该效应独立于姜黄素对LXRa-ABCA1/SR-BI通路的激活效应。