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(一)从动物水平研究低温诱导的液体复苏对失血性休克大鼠炎症小体活化的影响目的探索治疗性低温对失血性休克(hemorrhagic shock,HS)大鼠肺组织炎症小体活化的影响。方法本研究将24只SD大鼠随机分成3组:假手术组,常温液体复苏(normothermia resuscitation,NR)组,低温液体复苏(hypothermia resuscitation,HR)组。各组通过股动脉放血到平均动脉压40mm Hg保持1小时建立HS模型,随后NR组和HR组通过液体复苏使平均动脉压达90mm Hg,维持1小时,4小时后通过放血处死各组大鼠,留取大鼠肺组织。经苏木精-伊红染色于光镜下观察肺组织的损伤程度,使用湿/干比重法检测肺组织水肿情况,采用q RT-PCR和Western blotting检测肺组织炎症小体NLRP-3、caspase-1、IL-1βm RNA和蛋白表达水平。组间数据比较采用t检验,P<0.05为差异具有统计学意义。结果(1)HE染色提示:与NR组相比,HR组急性肺损伤程度明显较低。(2)肺组织湿/干比重与HR组相比NR组肺水肿显著降低[HR组5.85±0.102;NR组6.471±0.1658(t=3.14,P<0.05)];(3)与NR组相比,HR组的NLRP-3和caspase-1的蛋白表达均显著减少;(4)与NR组相比,HR组的NLRP-3 m RNA表达水平显著降低[HR组1.027±0.143,NR组1.3487±0.163(t=4.36,P<0.05)];HR组的IL-1βm RNA表达水平显著降低[HR 1.623±0.125,NR组2.388±0.229(t=7.72,P<0.05)]。结论治疗性低温能够降低炎症小体信号通路的活化,从而减弱HS诱导的肺组织损伤。(二)治疗性低温保护内皮细胞缺血再灌注损伤线粒体功能目的失血性休克引起的缺血再灌注损伤引起细胞氧化呼吸链的断裂,产生大量的氧自由基,造成线粒体的损伤。治疗性低温对缺血再灌注线粒体功能是否有保护作用。本实验将进行模拟内皮细胞缺血再灌注损伤研究治疗性低温对线粒体功能的影响。方法将HUVECs在无血清,无糖,p H为6.9,37℃的培养基,37℃低氧培养6h后,恢复给氧条件在含血清,p H为7.4的培养基分别在31℃和37℃条件下培养2h,流式细胞仪检测细胞凋亡程度和线粒体膜电位;免疫荧光检测细胞线粒体的数量;荧光素-荧光素酶试剂(Cell Titer-Glo,Santa)测定细胞内ATP含量;结果低温治疗减轻模拟缺血再灌注损伤细胞凋亡[31℃组9.23±1.772;37℃组12.63±1.943(t=3.139,P<0.05)]。免疫荧光检测线粒体的数目,31℃相对于37℃的复氧对细胞线粒体有保护作用。低温治疗提高维持缺氧复氧线粒体ATP浓度[31℃组9.65±2.134;37℃组14.58±1.316(t=-4.82,P<0.05)]。低温治疗降低线粒体的膜电位的损伤[31℃组46.88±11.857;37℃组26.17±7.233(t=3.65,P<0.05)]。结论治疗性低温保护内皮细胞缺血再灌注损伤线粒体功能,减少细胞的凋亡。(三)治疗性低温保护内皮细胞减弱缺血再灌注炎症小体活化目的失血性休克激活炎症通路,产生大量的炎症介质,从而造成组织细胞的损伤。本实验将进行模拟内皮细胞缺血再灌注研究治疗性低温对于炎症小体NLRP3活化的影响。方法将HUVECs在无血清,无糖,p H为6.9,37℃培养基低氧培养6 h后,恢复给氧条件在含血清,应用NLRP3的抑制剂BAY11-7082进行干预,p H为7.4的培养基分别在31℃和37℃条件下培养2h。Western blotting检测细胞caspase-1和NLRP3的蛋白表达;流式细胞仪检测细胞ROS的水平;ELISA检测培养液中IL-1β和IL-18含量。结果31℃组炎症小体NLRP3蛋白表达显著低于37℃组。caspase-1蛋白表达31℃组显著低于37℃组,但两者均高于对照组。应用NLRP3炎症小体抑制剂BAY11-7082显示,NLRP3和caspase-1的蛋白表达均降低。低温对于对于内皮细胞能够减轻缺氧复氧过程中的ROS的浓度[37℃组765.32±20.358;31℃组679.80±17.472,P<0.05,t=7.808]。31℃组炎症介质IL-1β表达显著低于37℃组[37℃组496.49±52.671;31℃组315.57±23.168,(P<0.05,t=7.701)]。应用NLRP3炎症小体抑制剂BAY11-7082显示,37℃与31℃复苏均降低IL-1β表达均降低,但两者相比较差异无统计学意义。[31℃组63.49±18.374;37℃组70.21±14.52,(P>0.05,t=-0.702)]。IL-18蛋白表达31℃组显著低于37℃组[37℃组362.62±33.163;31℃组317.34±28.450,(P<0.05,t=2.538)]。应用NLRP3炎症小体抑制剂BAY11-7082显示,IL-18的蛋白表达降低[31℃组63.93±13.225;37℃组73.18±14.479,(P>0.05,t=-1.155)]。结论治疗性低温保护内皮细胞缺血再灌注损伤,减轻ROS的产生及其诱导的炎症小体NLRP3的活化,减少炎症介质IL-1β及IL-18的蛋白表达。