真姬菇是一种低温结实性品种,其常规栽培易受环境因子的影响,造成产量不稳定,质量波动。当前由于遗传技术的研究相对落后,这些生产问题背后的遗传机制仍未明确。因此,开发高效的基因编辑技术对研究真姬菇生长发育以及开展精准分子育种具有重要的意义。本研究将真姬菇单核体菌株F4作为供试野生型菌株,利用花椰菜病毒35S RNA启动子（Ca MV35S）以及真姬菇甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子（gpd）分别驱动外源基因Cas9的表达,并在Cas9的3’端通过核酶融合了靶向ura5基因（编码乳清酸磷酸核糖转移酶）的引导RNA（g RNA）序列,构建了phm Cas9和pgpd-cas9两个质粒。通过生物信息学分析,发现真姬菇存在四个U6启动子,进一步利用这四个三型启动子设计了靶向ura5的转录框,并和Cas9表达框融合构建了pgpd-cas9-u1、pgpd-cas9-u2、pgpd-cas9-u3、pgpdcas9-u4四个质粒。通过农杆菌EHA105介导,将这些质粒分别导入真姬菇野生型单核体菌株F4的节孢子中,利用质粒中含有的萎锈灵抗性基因筛选转化菌株,获得28个Ca MV35S启动子驱动的拟转化子、71个gpd启动子驱动的拟转化子,共获得99个拟转化子,经分子鉴定,99个均为阳性转化子,且均有表型;通过RT-PCR对阳性转化子中Cas9基因的表达情况进行定量分析。结果表明,Ca MV35S和gpd启动子均成功驱动了Cas9基因在真姬菇中的转录,且gpd启动子驱动Cas9基因的表达高于Ca MV35S启动子,约高3～20倍,表明gpd启动子在真姬菇中驱动外源基因表达的能力更高。本研究以农杆菌介导的转化技术（ATMT）为前提,获得了含有Cas9基因的转化子,且转化子中抗性基因可以稳定遗传;同时,Cas9基因的转入对转化子的菌丝形态没有造成影响。本研究的结果为真姬菇中高效表达Cas9基因提供了技术路线,下一步可重点研究Cas9虽然有转录但是翻译水平过低或并未翻译的原因以构建高效真姬菇基因编辑技术。