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黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的典型成员。CMV寄主范围极为广泛,可以侵染85个科的1000多种植物,是引起许多重要经济作物的病毒病的主要病原之一。CMV为三分体+ssRNA病毒,主要通过突变、重组和假重组等方式进行变异和进化,使之能够不断适应新的环境和新的寄主。目前国内外对CMV全基因组序列分析的研究报道较多,GenBank登陆了全基因组序列的CMv株系已近20株。尽管有关CMV的人工假重组体的研究已有不少,但目前国际上还没有研究涉及该病毒种内天然假重组株系的全基因组序列分析,也没有具体的关于CMv种内天然假重组株系的分子生物学研究报道。
本研究在2005年采样自上海郊区自然感病的番茄样品中检测到一株CMV,并对寄主叶组织进行总RNA提取、RT-PCR扩增和克隆测序,首次获得了一株CMv种内天然假重组株系的全基因组序列,并命名该CMV株系为Tsh-CMV。对Tsh-CMV全序列分析结果表明:Tsh-CMV的RNA1全长为3394nt,内含1aORF,编码994个氨基酸的1a蛋白(96-3077)。Fsh-CMV RNA2全长为3047nt,包含两个ORF。其中2a ORF(86-2659)编码858个氨基酸的2a蛋白。2bORF(2418-2750)的5端与2aORF的3端重叠,编码111个氨基酸的2b蛋白。Tsh-CMV RNA3全长2206nt,内含两个ORF。其中3a ORF(97-936)编码280个氨基酸的3a蛋白,CP ORF(1229-1885)编码219个氨基酸的CP蛋白。Tsh-CMV与其他亚组CMv代表株系的序列同源性分析比较表明,Tsh-CMV的RNA1与亚组Ⅱ的标准株系Q的核苷酸序列同源性最高,为97.5﹪;而与亚组IA和IB的代表性株系Fny和Sd的核苷酸序列同源性却小于78﹪。Tsh-CMV的RNA2与Fny的核苷酸序列同源性高达96﹪,与Sd和Q的核苷酸序列同源性分别只有90.4﹪和71.2﹪。Tsh-CMV RNA3与Q的核苷酸序列同源性高达98.3﹪,而与Fnv和Sd的同源性只有74﹪左右。这表明Tsh-CMV的RNA1和RNA3来源于CMV亚组Ⅱ株系,而RNA2却来源于亚组IA株系。对Ysh-CMV的5个ORF的核苷酸和氨基酸序列同源性比较和进化树分析也得出了同样的结论。
虽然Tsh-CMV全序列分析结果表明它是一株CMV亚组IA RNA2和亚组Ⅱ RNA1和RNA3之间的假重组株系,但是这种结果也可能是由于不同亚组CMV株系复合侵染番茄造成的。本研究建立了一种基于RT-PCR和限制性酶切鉴定的方法对番茄样品中的CMV复合侵染的可能性进行了研究。该方法不仅可以用于鉴定亚组Ⅰ和亚组Ⅱ CMV株系之间的复合侵染,也可以用于对不同CMV株系的三条基因组RNA链进行快速地分组鉴定。与传统的Northern杂交方法相比,该方法具有简便和快速的特点,特别适合于对大批量样品的检测与鉴定。对采自上海的自然染病的番茄进行检测的结果表明,在上海的番茄样品中并不存在不同亚组CMV株系复合侵染的现象。以上研究结果表明:Tsh-CMV是一株由CMV亚组IA和亚组Ⅱ株系通过假重组形成的新株系。本研究还通过RT-PCR的方法构建了Tsh-CMV的RNA2和RNA3的侵染性克隆,成功地通过体外转录获得了具有侵染活性的 Tsh-CMV RNA2和RNA3的RNA转录本。将 Tsh-CMlV的RNA2和RNA3的侵染性转录本与Fny-CMVRNA1的侵染性转录本混合后接种心叶烟,成功得到了人工假重组体F1T2T3。