纤维素酶是由三种不同的酶组成的多酶复合物：外切葡聚糖酶,内切葡聚糖酶和p-葡萄糖苷酶(BGL),三种酶协同作用完成对纤维素的水解。p-葡萄糖苷酶作为纤维素酶水解纤维素过程的限速酶,成为酶解木质纤维素生成生物乙醇的瓶颈。目前,如何提高p-葡萄糖苷酶的活力及产量,优化纤维素酶系的构成已成为了研究的一大热点。本文以本实验室从黄山腐木中筛选得到的匍枝根霉TP-02为出发菌株,获取其p-葡萄糖苷酶基因并对关键位点进行改造,纯化获得重组蛋白并研究其酶学性质,结合软件模拟与实验探究p-葡萄糖苷酶的结构与功能,并构建了具有强启动子的匍枝根霉转化子。主要研究内容包括：(1)本研究成功提取了匍枝根霉基因组DNA并且合成了cDNA单链,并从中克隆到一个新p-葡萄糖苷酶基因bgl3(基因登录号为KP115896)。将其连接pET22b载体,转化大肠杆菌BL21,实现p-葡萄糖苷酶的原核表达。发酵结果表明,重组菌在25℃,0.1mmol/L IPTG培养条件下,发酵12h达到酶活最高值,为0.788IU/mL。(2)借助一系列生物信息学软件预测和分析bgl3基因的基本特性、保守功能域等信息。分析结果表明：bgl3基因全长1452 bp,编码484个氨基酸,其基因产物BGⅢ含两个典型的GH1特征序列,归属于糖苷水解酶第1家族。BGⅢ没有典型的跨膜区存在,理论上为可溶性较好的球蛋白。(3)对BGⅢ和GH1序列进行比对分析及结构模拟,利用DS 2.5软件进行了BGLⅢ蛋白的同源建模,并且以纤维二糖为底物进行了分子对接,模拟了酶与底物在活性中心的相互作用过程。结果显示,BGLⅢ三级结构为经典的(α/β)8-TIM桶结构类似,活性位点包含两个关键的谷氨酸残基。纤维二糖模型紧贴着结合口袋壁,深入到结合口袋中,在各关键残基的作用下分解为葡萄糖。根据生物信息学及分子动力学分析结果,确定Trp127为研究重点,并将Trp127突变为不同侧链的Ala, Phe和Leu。Trp位于活性中心一侧,且在活性中心与底物结合过程中扮演重要的角色。Trp127当突变为不带侧链的Ala时,与Glu173空间距离增大,空间位阻发生变化,不能维持糖苷结合位点原有构象,导致酶活大幅度降低；而当突变为具有相同苯环侧链的Phe时,与其他残基氢键及疏水作用力变化不大,进一步证明氨基酸空间构象对底物活性中心的重要性；当突变为具有带有非苯环长链的Leu时,酶活较大提高,可能是由于Leu的长链在维持原有构象的基础上,Tyr315和Glu384与底物空间距离缩短,氢键能量增加,使得水解p-1,4糖苷键作用力增强,同时葡萄糖的疏水作用的增强,进一步提高葡萄糖耐受性。(4)利用重叠PCR完成目的位点的分子改造,成功筛选3株原核重组菌。发酵结果显示pET-22b(+)-W127L在IPTG诱导后12 h酶活达到最好,为1.090 IU/mL,较pET-22b(+)-W127提高了34.07%；对原始重组菌和个突变株的SDS-PAGE结果表明,BGIII的分子量为54kDa。其中pET-22b(+)-W127L的目的条带最粗,表达量较高。(5)分别对各重组蛋白进行纯化和酶学性质分析。BGLⅢ采用亲和层析和离子交换层析进行纯化,获得54 kDa的蛋白。酶学性质分析表明,BGLⅢ最适温度为55℃,并且30℃至60℃之间保持90%以上的酶活力,具有广泛温度适应性。而在70℃以上时,酶活力迅速下降,相对酶活力不到10%。最佳pH值和pH值适应性研究表明,BGLⅢ最适pH值为5.0,并且酶在pH为4至7时,都能保持80%以上的活性。金属离子对BGLⅢ的影响研究表明,Mg2、Mn2+和Fe2+对BGLⅢ活性有促进作用,其中Mg2+增强作用最明显；Hg2+、Ca2+、K+、Cu2+和Zn2+则对BGLⅢ活性有抑制作用,其中,Hg2+和Cu2+比较明显,Cu2+存在时,BGLⅢ活性不到10%,而当Hg2+存在时,BGLⅢ活性完全丧失。(6)以黑曲霉基因组DNA为模板,克隆得到糖化酶启动子PglaA基因片段。利用重叠PCR方法,将glaA与bgl3连接,构建融合基因glaA-bgl3。为融合基因glaA-bgl3构建同源臂,并添加潮霉素B筛选标记,成功转化匍枝根霉分生孢子。对转化子和出发菌株匍枝根霉TP-02进行发酵实验,结果表明：转化菌的p-葡萄糖苷酶活性相较匍枝根霉TP-02提高了23.9%。在实验研究基础上,结合生物信息学分析,对匍枝根霉p-葡萄糖苷酶BGLⅢ的结构与功能进行了初步分析探讨,构建了原核表达重组菌和匍枝根霉转化子,为匍枝根霉p-葡萄糖苷酶的深入研究提供基础。