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ETI是植物在长期进化过程中形成的一种重要抗性机制,符合“基因对基因假说”抗病性是其中一种。番茄(Solanum lycopersicum)与叶霉菌(Cladosporium fulvum)的互作是研究这一机制的经典模式系统。通过该系统,已经克隆了多个Cf基因及与其互补的无毒基因(Avr),对Cf-2、Cf-4和Cf-9的互作机制和信号传导途径也开展了较为深入的研究。虽然这些R基因序列高度相似,但互作机制不同。因此对Cf-4E/Avr4E的互作机制及信号传导途径研究会丰富Cf/Avr互作机制的理论,从而为抗病育种提供理论基础。本项目以实验室前期获得的由诱导型启动子驱动的共含Cf-4E与Avr4E转基因单拷贝本氏烟为研究材料,该材料能在雌二醇条件下,因强烈的过敏性坏死(Hypersensitive response,HR)导致种子全部不能萌发。在化学诱变剂处理后,如果Cf-4E、Avr4E或关键信号组分三者中任一基因发生突变,则种子在雌二醇条件下可以正常萌发并生长;反之,如果三者均未突变,则种子全部不萌发,可便捷的筛选不产生HR的突变体。基于上述原因,本论文开展了如下研究:(1)在化学诱变处理使,诱变剂处理浓度不同,诱变效果也不同,不同材料所需要诱变剂的适宜浓度不同,因此对EMS处理共含Cf-4E/Avr4E本氏烟进行了浓度筛选,确定其半致死浓度为0.34%,致死浓度为0.6%,以半致死浓度为选择标准,明确EMS诱变处理本氏烟种子的适宜浓度为0.35%。(2)为了提高突变率,用浓度为0.35%的EMS处理转基因种子后,对总计约320,000颗种子再经雌二醇处理,共获得223颗萌发的种子,将它们全部移入营养土中,大部分生长迟滞直至死亡。剩余87株存活,大多表现为白化、丛枝、黄化、细长、矮化、叶片畸形等。对上述阳性植株叶片注射雌二醇复筛后获得27株可能的目标植株(注射雌二醇不产生HR)。在这些株系中大多数不育,仅有12个株系能够收获种子。将12个株系种子播种于含雌二醇、卡那霉素和潮霉素培养基进一步筛选,最终获得5个阳性株系:分别为TB-9.2,TB-12.14,TB-19.1,TB-22.1,TB-31.2。为明确这些候选突变株系的真伪与突变发生的可能类型,采用农杆菌介导的瞬时共表达Cf-4E和/或Avr4E,以及注射雌二醇。结果表明:TB-9.2株系中的Cf-4E基因产生了功能性的突变;TB-22.1.8株系中的Avr4E基因发生了功能性的突变;TB-12.14以及TB-19.1株系是其介导产生HR的下游信号途径中关键的功能性基因发生了突变。对其中TB-9.2株系Cf-4E基因与原Cf-4E基因比对后发现并没有碱基上的突变,推测可能突变位点发生在诱导型启动子区,导致诱导型启动子功能丧失,失去应答雌二醇诱导能力,使Cf-4E不表达,造成Cf-4E基因发生功能性突变的假象。