论文部分内容阅读
猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus type 2,PCV2）作为一种免疫抑制性病毒,自1996年发现的二十多年来,一直是断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS）及其相关疾病的原发性病原,给世界范围内的养猪产业带来巨额经济损失。目前疫苗免疫接种是防控PCV2感染的主要对策。PCV2结构蛋白（Cap）作为重要的免疫原性蛋白,在体外表达后能自行组装成病毒样颗粒（Virus-like particle,VLPs）,已成为开发PCV2亚单位疫苗的理想靶抗原。国内外也先后有PCV2亚单位疫苗上市,但因亚单位疫苗成本高导致价格昂贵,难以在养猪业大规模推广使用。因此寻找新的技术策略,研制高效、安全、价廉的亚单位疫苗至关重要。本研究主要探索了PCV2截短Cap蛋白（dCap）在原核表达系统pET28a中的可溶性表达,并以猪为动物模型评价了所制备亚单位疫苗的免疫原性,在此基础上,进一步对重组表达菌的高密度发酵培养条件进行了探索。主要研究内容分以下三部分:1.PCV2 dCap蛋白的原核表达以本实验室保存毒株PCV2b 119-GD01编码的Cap蛋白氨基酸序列为基准,通过密码子优化和基因合成获得了去掉N端41个氨基酸序列的截短Cap基因（dCap）,并将dCap插入原核表达载体pET28a中,成功构建了重组质粒pET28a-dCap,经IPTG诱导表达后产物依次进行SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定,结果显示:诱导表达的蛋白大小约27 kDa,与理论值相符,并主要以可溶形式溶解于上清,约占上清总蛋白的40%,并且dCap能与PCV2 Cap蛋白单克隆抗体反应,表现良好的反应原性。2.PCV2 dCap蛋白亚单位疫苗的免疫剂量筛选及仔猪免疫效果评价将PCV2 dCap蛋白经镍柱亲和层析纯化获得高纯度蛋白,分别以不同抗原量（80μg/每只、60μg/每只、40μg/每只、20μg/每只）与铝胶佐剂按比例混合制备成亚单位疫苗,免疫6周龄SPF Balb/c小鼠,免后1周至7周每周眼眶静脉采血检测抗体变化情况。结果表明:各组疫苗免疫小鼠均能产生免疫应答;免疫后抗体水平与免疫剂量成正比例关系,且随免疫剂量增加,抗体达阳性时间也从第3周提前至第2周（≥60μg/每只）,综合结果得出最佳免疫剂量为80μg/每只。为评价试验疫苗对仔猪的免疫效果,0.8 mg dCap蛋白分别与201佐剂和铝胶佐剂乳化/混合制备成2组试验疫苗,并设疫苗对照组,分别免疫3周龄仔猪一次,同时设攻毒对照组和空白对照组。各组免疫后每周采血,并于免疫28天后进行PCV2（119-GD01毒株）攻毒试验,攻毒后28天剖杀,通过抗体检测、临床表现、体温变化、平均日增重和组织脏器载毒量等指标来进行疫苗免疫效力评估。其中为探索高低母源抗体对疫苗免疫效果的影响,3组免疫组组内又分为高母源抗体（H-MDA,S/P>0.3）和低母源抗体（L-MDA,S/P<0.16）进行分析,结果得出:（1）整体情况下,免疫组脏器载毒量均低于攻毒对照组,且H-MDA情况下,201佐剂+dCap蛋白组和疫苗对照组脏器载毒量与攻毒对照组差异显著（P<0.05）,说明试验疫苗具有较好的免疫原性;（2）H-MDA和L-MDA对疫苗免疫效果的影响:相比H-MDA免疫组,L-MDA免疫组能引起抗体水平的升高和平均日增重的增长,但差异并不显著（P>0.05）,表明H-MDA能一定程度干扰疫苗免疫效果,但大多数情况可忽略不计;（3）201佐剂与铝胶佐剂比较:相比铝胶佐剂+dCap蛋白组,201佐剂+dCap蛋白组能产生更高的抗体水平和平均日增重指数,L-MDA情况下明显降低脏器载毒量,表明对于dCap蛋白亚单位疫苗,201佐剂免疫效果优于铝胶佐剂,能刺激机体产生快速且持久的免疫应答反应。3.重组大肠杆菌pET28a-dCap高密度发酵培养条件优化在5 L发酵罐中,分别对诱导时机、诱导温度及诱导时间进行优化。获得优化的培养模式为:采用平衡DO-stat法（30%50%）来控制搅拌速度（≤800 rpm）、通气（≤8 L）及补料流加速率,以10%比例接种种子液,37℃发酵约7小时使菌体OD600达5055后,加入IPTG使终浓度达0.5 mmol/L,30℃诱导6小时。最终发酵液的菌体OD600达6065,上清中重组dCap蛋白表达量占菌体总蛋白的比例约为30%,每升菌液获得目的蛋白量约为2.6 g。所获重组dCap蛋白经盐析纯化后,通过小鼠免疫试验评估PCV2疫苗效果。结果表明:试验疫苗组明显优于疫苗对照组和PBS对照组,产生抗体的速度更快,水平更高,初步验证了发酵培养所获重组dCap蛋白的免疫效果,为后续大规模工业生产奠定基础。