H7N9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)自2013年首次报道以来，已导致我国人群中形成了五波流行高峰。截至2018年9月5日，实验室共确诊1567例人感染H7N9的病例，死亡率接近40％。其中2016～2017年的第五波流行高峰感染人数最多、波及范围最广，在此期间还分离到了对鸡呈高致病性的(Highly pathogenic，HP)的H7N9 AIV。与在我国流行20多年的亚洲HP H5N1病毒相比，H7N9亚型AIV在短短5年时间内造成的人类感染数量已经远远超过H5N1亚型AIV。人群中的H7N9散发病例均直接来自家禽感染。HP毒株和低致病性(Low pathogenic，LP)毒株并存的复杂状况给我国养禽业和公共卫生构成了重大威胁，因此，研究我国家禽中H7N9亚型AIV的遗传进化特点和毒株的生物学特性并掌握其流行趋势十分必要。因为人类感染的H7N9 AIV主要来自家禽，所以家禽中H7N9病毒的监测和防控是控制和减少人类感染的最有效措施，因此，快速检测方法的建立及免疫原性良好的禽用疫苗储备就显得刻不容缓。同时，研究H7N9亚型AIV对家禽的致病机制可以为更有效的防控策略提供科学依据，家禽中同时存在的HP和LP H7N9病毒给新发现的PA-X蛋白功能的研究提供了良好的病毒模型。目前还没有针对H7N9亚型AIV PA-X蛋白作用的研究，因此探索PA-X对H7N9病毒致病性及宿主抗病毒免疫的影响不仅能够揭示PA-X蛋白在新型流感病毒感染中的关键作用，也能够推进H7N9病毒致病机制的研究。　　本研究在对我国鸡群中H7N9亚型AIV进行流行病学监测的基础上，对本实验室2013-2017年分离到的H7N9亚型AIVs进行了遗传进化分析，并对部分HP H7N9进行了生物学特性的鉴定。针对当前H7N9流行现状，成功构建了免疫效力良好RGW疫苗候选株并建立了灵敏度高的且能区别H7N9强弱毒的MGB RRT-PCR检测方法;同时研究了PA-X在高、低致病性H7N9病毒中调节复制能力和致病性的作用机理。　　1.2013年以来我国鸡群中H7N9亚型禽流感病毒遗传进化及生物学特性分析　　根据2013年以来本实验室在我国部分鸡场和活禽市场(Live poultry market，LPM)进行的禽流感病原学监测，我们对2013～2017年分离到的116株H7N9亚型AIVs进行了流行病学及遗传进化分析。研究表明，禽源H7N9病毒已经在我国获得常在性地方流行，家禽中H7N9的流行高峰时间和流行区域与人源H7N9类似，进一步证实了人源H7N9与禽源H7N9病毒高度同源。遗传进化树显示，监测期间H7N9亚型AIV的HA基因和NA基因均按照分离年份进行聚类。但是第五波流行高峰期间（2016年10月～2017年3月）分离到的HP H7N9毒株却独立于2015年的进化分支内而与2016～2017年的分离株相距较远，提示我们HP H7N9分离株可能来源于2015年的毒株。内部基因进化总体相对保守，大部分毒株的内部基因均来源于优势S基因型的H9N2病毒，即PB2和M基因属于G1-like谱系而其他内部基因为F98-like谱系。但值得注意的是，分离株PB2基因分成了两个明显的进化分支且2015年部分毒株出现了F98-like谱系的M基因，提示我们H7N9在进化过程中仍然可能进行着基因的重配。　　关键氨基酸位点的分析显示，在第五波流行高峰期间我们分离到了7株裂解位点具有4个氨基酸插入的HP H7N9，这些病毒裂解位点的氨基酸序列存在两种模式(PEVPKGKRTAR↓GLF和PEVPKRKRTAR↓GLF)。在重要的受体结合位点处，HA蛋白G186V及Q226L的变化意味着大部分禽源H7N9亚型AIV已经具有结合人类和禽类的双受体结合特性。HA抗原A区R140K突变比例逐年增多，提示我们H7N9在进化的过程中有可能已经产生了抗原漂移。同时，H7N9分离株PB2-K526R、PB1-I368V、PA-K356R、NS1-P42S的位点发生了普遍的或者逐年的变异，提示我们禽源H7N9已经获得了在小鼠中增殖和毒力增强的潜力，这些病毒如果一旦获得在哺乳动物体内的适应将会对公共卫生构成巨大威胁。　　HP H7N9的生物学特性和动物实验结果显示，分离株在对鸡呈高致病性的同时，对小鼠的毒力却各不相同，GD15株在小鼠和鸡中均呈现出了比GD4株更强的复制能力和毒力，这是否和其不同的裂解位点模式有关还需要进一步研究。同时SPF鸡感染传播实验提示我们H7N9亚型AIV的传播方式虽局限于接触传播，但传播效率非常高。　　2.高致病性H7N9禽流感病毒疫苗候选株的构建及基于Taqman-MGB探针RRT-PCR检测方法的建立　　为了有效防控H7N9亚型AIV在家禽中流行与传播，本研究根据当前H7N9流行情况和遗传进化特点，有针对性地构建了免疫效力良好的RGW疫苗候选株并建立了鉴别诊断不同毒力H7N9病毒的Taqman-MGB探针RRT-PCR检测方法。　　我们利用突变及反向遗传手段成功构建了重组致弱的疫苗株RGW，该疫苗株选择了GD15的裂解位点致弱的HA和NA作为供体外部基因，内部基因来源于同为S基因型的H9N2亚型疫苗株WJ57，还原性突变策略不仅使强毒株的毒力变弱，同时也能保证其良好的免疫原性，使疫苗株RGW能同时预防高致病性H7N9和低致病性H7N9病毒的感染。RGW株保持了母本毒株良好的繁殖特性和免疫原性，经10次传代后依然具有11 log2的高效价，在免疫鸡后四个月后仍保持8log2的高滴度抗体。RGW不仅能对高致病性H7N9亚型流感病毒产生高滴度的HI抗体，对当前流行的低致病性H7N9也有很好的交叉反应性，交叉保护滴度均≥9log2。同时，RGW疫苗株在具有100％临床保护（死亡保护）的前提下，其排毒保护也能高达80％～100％，可以有效控制H7N9病毒在鸡群中流行及传播，从而也可以减少人类与禽类接触而感染病毒。　　当前H7N9亚型禽流感病毒存在着高致病性毒株和低致病性毒株共同流行的现状，快速区分强弱毒H7N9检测方法的建立极为必要。因此我们基于Taqman-MGB探针技术建立了一种可以鉴别诊断不同毒力H7N9的双通道RRT-PCR方法，该方法首次将MGB探针技术用于H7N9病毒的检测。Taqman-MGB探针相比于普通RRT-PCR方法有着更高的灵敏度，本方法针对不同毒力H7N9的不同模式裂解位点序列设计了探针，在双通道条件下能够高效地特异性检测HP-H7N9及LP-H7N9并达到区分的效果，灵敏度达50拷贝。相比于传统的鸡胚分离和RT-PCR方法，该方法总符合率达92.7％且敏感性更好，临床操作更加简便快速，同时又避免了传统方法中可能存在的交叉污染。　　3.PA-X蛋白在高、低致病性H7N9禽流感病毒感染中的作用及其机制研究　　为了探索PA-X蛋白在不同致病性H7N9病毒感染过程中的作用，我们以高致病性毒株A/chicken/Guangdong/GD15/2016(GD15)及其裂解位点致弱的低致病性毒株r15为研究对象，通过对PA基因核糖体移码区的改造，成功构建了PA-X表达量下降的高致病性突变病毒GD15-PAX3、GD15-PAX5和低致病性突变病毒r15-PAX3、r15-PAX5。本研究系统地比较了母本病毒和突变毒株在病毒感染过程中的差异。　　当以高致病性毒株为骨架时，与母本病毒GD15比，突变病毒GD15-PAX3、GD15-PAX5对SPF鸡胚的毒力增强，在MDCK和DF-1细胞和SPF鸡体内的复制能力增强;在哺乳动物和禽类细胞中的聚合酶活性增强;同时在病毒诱导的细胞凋亡能力方面也增强;然而，鸡的肺脏差异转录组学分析结果显示，GD15-PAX3所诱导的宿主先天性免疫应答能力却低于母本病毒，主要表现在GD15-PAX3诱导的显著差异表达的基因个数要低于母本病毒GD15，并且刺激宿主IL-6、IL-18、INF-β等重要炎性细胞因子应答水平也显著低于母本病毒。因此，当以高致病性毒株为骨架时，PA-X能显著抑制病毒的复制能力和病毒诱导的细胞凋亡，增强了宿主的先天性免疫应答能力。　　然而，当以低致病性毒株为骨架时，大部分结果与以高致病性毒株为骨架的结果相反，主要体现在，与母本病毒r15相比，突变病毒r15-PAX3、r15-PAX5在体内和体外的复制能力、在哺乳动物和禽类细胞中的聚合酶活性、在病毒诱导的细胞凋亡能力方面均显著降低。但是，鸡的肺脏差异转录组学分析结果显示，r15-PAX3所诱导的宿主先天性免疫应答差异基因的个数要低于母本病毒r15，但是IL-6、IL-18、TNF-α等重要的炎性细胞因子表达水平却显著提升。因此，当以低致病性毒株为骨架时，PA-X能显著增强病毒的复制能力和病毒诱导的细胞凋亡，抑制宿主的先天性免疫应答能力。　　因此，本章的研究结果首次发现PA-X蛋白在HP/LP H7N9病毒中起到调节复制能力和病毒毒力的作用，并且发现H7N9病毒PA-X蛋白无法诱导鸡肺脏显著的“Host shutoff”活性，推测PA-X蛋白抑制宿主蛋白表达的能力可能存在宿主或亚型特异性。同时我们的结果也表明PA-X可能通过调节炎性细胞因子的应答水平和不同程度的细胞凋亡来调节高/低致病性H7N9病毒的复制能力和致病性。因此，本研究推进了我们对HP/LP H7N9病毒致病机制的了解。