目的骨髓基质细胞(Bone Marrow Stromal Cells，BMSCs)是中胚层来源的干细胞。基于其多分化潜能、容易在体外扩增的特性，BMSCs被认为是理想的外源基因转移的靶细胞。脑源性神经营养因子(brain derived neurotroph factor，BDNF)是神经生长因子家族的重要成员，BDNF能够促进运动神经元的存活、分化和生长。本实验中，我们通过构建携带脑源性神经营养因子(brain derived neurotroph factor，BDNF)的真核表达载体PcDNA3.1-BDNF，用脂质体法转染骨髓基质干细胞，观察在BMSCs中的过量表达对移植细胞体外分化的影响，同时将其移植到脊髓损伤模型大鼠脊髓组织，评估功能恢复情况并通过免疫组织化学分析大鼠损伤脊髓caspase-3的表达。探讨BMSCs治疗脊髓损伤新途径。实验材料与方法一、BMSCs的培养1、采用原代培养进行BMSCs的培养；2、采用免疫荧光染色法对培养的BMSCs进行鉴定，进行CD44染色；3、BMSCs向神经元样细胞的定向诱导分化，进行NSE、GFAP染色；二、真核表达载体的构建及细胞转染1、从挪威大鼠血清中提取DNA，构建真核表达载体PcDNA3.1-BDNF并鉴定；2、离子脂质体法转染BMSCs细胞并筛选；3、采用Western Blotting检测基因转染细胞中BDNF蛋白的表达；4、RT-PCR鉴定BDNF转染BMSCs中基因的表达；三、动物模型制作及细胞移植1、采用改良的ALLen’s打击法制作脊髓损伤动物模型2、随机分为脊髓挫伤对照组(A组)；脊髓挫伤后BMSCs组(B组)；脊髓挫伤后转BDNF的BMSCs组(C组)。分为术后1，3，7，21天4个时相点，每个时相点每组6只大鼠。3、BMSC和转染后的BMSCs移植入大鼠损伤脊髓局部；四、结果检测1、用改良的Tarlov评分进行行为学检查；2、免疫组织化学反应检测caspase-33、所有数据均以(?)±s表示，采用SPSS统计软件进行分析，数据采用q检验(Newman-keuls法)和t检验进行统计分析。实验结果1、BMSCs的生长与鉴定24小时后见少量细胞贴壁生长，呈圆形、发亮，大部分细胞仍浮在培养液中。随着时间延长，贴壁细胞增多，分布不均，呈集落趋势生长。一周后呈纤维状密集生长。在细胞覆盖约80％培养瓶底时传代，传至第2-3代时应用免疫荧光方法鉴定BMSCs标志抗原CD44，荧光镜下见阳性细胞呈淡绿色荧光，在同一视野下观察明视野下细胞生长，同荧光视野相比较，95％以上细胞为CD44阳性细胞。2、BMSCs的体外定向诱导分化及免疫组织化学检测BMSCs经正常脊髓提取液和BDNF诱导24小时后，部分细胞形态发生明显改变。这些细胞胞体变小，胞质向核周收缩，由原来的梭形变成圆形。随着时间的延长，神经元样细胞增多。取诱导14天的细胞进行免疫组化染色，大多数细胞呈NSE、GFAP阳性，呈棕褐色，胞体和突起均有表达。NSE阳性细胞率为79.7％±2.6％，GFAP阳性细胞率为66.8％±5.7％。对照组细胞NSE，GFAP的表达很少。3、BDNF基因重组体的鉴定从大鼠基因组DNA中PCR扩增BDNF基因，产物进行琼脂糖凝胶电泳，片段大小符合预期，阴性对照组无片断扩增出。用BDNF上下游引物pBDNFf和pBDNFr对构建好的PcDNA3.1-BDNF进行PCR分析电泳，并经过DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒。4、RT-PCR与Western Blotting显示筛选出的G418抗性BDNF转染BMSCs中有BDNF蛋白的明显表达。5、行为学检查情况术后1d A组、B组、C组大鼠都表现为双后肢瘫痪，行为学观察无明显差别。7d时B组、C组大鼠运动功能明显好于A组(P<0.05)，21d时B组、C组大鼠已能行走，A组大鼠则行走困难。6、脊髓损伤后caspase-3免疫反应阳性细胞数的变化术后1d各组脊髓caspase-3免疫反应阳性细胞都明显增加，A、B两组增加显著。术后3d、7d C组caspase-3免疫反应阳性细胞增加较少。术后1-14d其他各组与A组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。讨论脊髓损伤造成的严重而不可逆的运动功能丧失是由于损伤脊髓局部的运动神经元缺失造成的。最近研究表明内源性神经营养因子减少同神经元存活减少甚至死亡有关，因此可以相信脊髓损伤同神经营养因子存在密切联系。脑源性神经营养因子(brain derived neurotroph factor，BDNF)是神经生长因子家族的重要成员，BDNF在正常SC的分布提示其在维持SC的正常发育中起重要作用。脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)后，BDNF及其mRNA的表达均较损伤前明显增加。BDNF表达的增加在挽救受损SC神经元存活和促进神经突起再生方面具有重要意义。因此BDNF受到越来越多的重视。最近研究表明，BDNF基因修饰型细胞移植(即转基因移植)有望成为应用BDNF治疗SCI的最有效方法。BMSCs由于具有多分化潜能，容易在体外扩增，容易转染等特点而成为基因治疗的良好靶细胞。本实验中，我们在体外培养了BMSCs并用脂质体介导PcDNA3.1-BDNF转染，获得了抗G418的细胞克隆，并从mRNA水平及蛋白水平证实了转染后的BMSCs可长期稳定表达外源BDNF，为下一步的实验提供了可靠的保证。本实验发现，在大鼠脊髓损伤区的近端和远端大量脊髓细胞表达激活状态的caspase-3，脊髓损伤后，caspase-3免疫反应阳性细胞在B组、C组依次减少(P<0.05)，证实BMSCs移植可以抑制细胞凋亡，对受损脊髓细胞起保护作用。而术后C组caspase-3免疫反应阳性细胞增加较少，术后7d时caspase-3免疫反应阳性细胞达高峰，在21d处于较低水平。说明脊髓损伤后BDNF的真核表达载体转染的BMSCs移植可抑制caspase-3激活，免疫反应阳性细胞增加明显减少。由此推测大鼠脊髓损伤应用PcDNA3.1-BDNF体外转基因BMSCs移植，不仅可以提供较多的BDNF、下调caspase-3，而且还可以维持宿主损伤脊髓神经细胞的存活、生长、发育和功能状态，促进其修复，阻断脊髓神经元和胶质细胞凋亡的信号转导途径，从而阻止或减轻损伤脊髓的细胞凋亡。BMSCs已经在众多临床前期实验中被用于修复各种组织损伤。越来越多的转基因细胞移植治疗被用于脊髓损伤的修复。本实验结果不仅探讨了大鼠脊髓损伤中PcDNA3.1-BDNF体外转基因BMSCs移植的修复机制，更为BDNF基因修饰型细胞移植治疗SCI提供了一条有效、安全的新的发展方向。结论1、BMSCs可在体外经BDNF与脊髓提取物定向诱导为神经元样细胞。2、脂质体法介导的外源性目的基因BDNFcDNA在BMSCs中成功表达。3、移植真核表达载体PcDNA3.1-BDNF转染的BMSCs可促进损伤的脊髓存活和再生，较单纯应用BMSCs能更好地促进脊髓损伤修复。