苹果树腐烂病(Apple canker)是黑腐皮壳属真菌(Valsa mali)引起的一种枝干皮层腐烂病害,现称为果树癌症,严重影响着我国苹果产业的发展。目前,对Valsa mali的次级代谢产物了解相对较少,前期研究发现该病菌野生型菌株03-8代谢产生的粗蛋白具有致病活性,但尚未对活性蛋白进行分离纯化。另外对其代谢产生的挥发性物质尚未见报道。因此本实验对03-8产生的活性蛋白的分离方法进行了探索,并在此基础上纯化具有致病活性的蛋白,同时对该病菌代谢产生的挥发性致病活性物质进行分离和结构鉴定,取得的结果如下:1.分别以蛋白相对含量、电泳条带清晰程度和对苹果叶片的致病活性为判断依据,比较了丙酮沉淀法、TCA沉淀法、硫酸铵沉淀法及pH分级沉淀法四种蛋白沉淀方法对03-8的1%麦芽浸膏汤发酵液中的蛋白的提取效果。结果发现:(1)对硫酸铵分级沉淀中硫酸铵的饱和度进行探索,结果发现:当硫酸铵饱和度为50%时沉淀的蛋白相对含量最高,活性也最为明显。因此硫酸铵沉淀法中使用50%硫酸铵饱和度。(2)对pH分级沉淀中不同pH下所得沉淀进行分析,结果发现,pH 2的沉淀中蛋白相对含量和活性方面均不及pH 5和pH 6所得沉淀,但活性明显,更重要的是其在SDS-PAGE电泳图谱中蛋白条带清晰,数量较少,容易分离纯化。因此pH沉淀法中采用pH 2所得沉淀。(3)将4种蛋白沉淀方法进行比较,发现蛋白相对含量顺序为:pH沉淀法>硫酸铵沉淀法>TCA沉淀法>丙酮沉淀法;SDS-PAGE电泳图谱中条带清晰程度为:硫酸铵沉淀法>pH沉淀法>TCA沉淀法和丙酮沉淀法,条带数目为:硫酸铵沉淀法>pH沉淀法;生物活性由强到弱为:pH沉淀法>硫酸铵沉淀法>丙酮沉淀法>TCA沉淀法。综合分析证明,pH沉淀法得到的沉淀中蛋白相对含量最高,SDS-PAGE电泳图谱中条带清晰且数目较少,生物活性也较强。因此,本实验选择pH沉淀法作为粗蛋白的提取方法。2.将pH沉淀法得到的粗蛋白用AKTA蛋白纯化层析系统进一步纯化,纯化后的蛋白对苹果叶片有明显的致病活性,对烟叶则无活性,其蛋白条带经LC-MS-MS鉴定,根据可信度评估及分子量筛选,共得到3个肽序列:AGFAGDDAPR、AGFAGDDVPK、QEYEGALRR。3.以乙酸乙酯为溶剂采用普通蒸馏法收集03-8培养滤液中的挥发性代谢产物,通过GC-MS分析,与数据库标准物质质谱图对比以鉴定其结构,用苹果枝条进行致病活性测定。鉴定了其中的两种化合物,其结构分别为异戊醇和2-苯乙醇。这两种物质均对苹果树枝具有致病活性,异戊醇对苹果树枝条的致病活性相对较弱,2-苯乙醇对苹果树枝条的致病活性相对较强。