背景随着社会的进步,人类在日常生活中接触电离辐射的机会越来越多,因此受到的辐射损伤也越来越多。男性的生殖系统对电离辐射高度敏感,射线会使精子浓度、活率、活力、形态结构、染色体以及DNA等会发生一系列的改变或损伤,导致男性生育力下降或/和子代发育不良。目前,中药复方对生殖系统辐射损伤防护的研究仍然较少,近几年来,课题组对源自临床并经实验室优化的中药复方——益气解毒方进行了一系列研究,发现该方可有效减轻睾丸辐射损伤。所以,本研究将继续深入探讨电离辐射对雄性生育力的影响以及益气解毒方的防治效果。目的梳理中医古籍文献“肾主生殖”的理论,并基于此深入探讨男子生殖之精与胎孕的关系,以期为男子精子质量下降所致生育能力障碍的病因、病机分析及治疗提供中医理论指导。结合实验,利用电离辐射损伤动物模型,观察电离辐射对小鼠精子质量及其生育能力的影响以及益气解毒方的防治效果,并探讨TLR5信号通路在以上病理过程的调控作用。方法理论研究:通过查阅中医古籍文献,总结“肾主生殖”中医理论的特点,对“肾主生殖”的理论基础进行梳理,再辨析肾精以及男子生殖之精的关系,进而探讨男子生殖之精对胎孕的影响,完善男性不育症的中医理论。实验研究:实验一:将24只雄性Balb/c小鼠根据体质量按随机数字表法随机分成空白组、模型组和益气解毒方组。空白组小鼠进行假照射作为空白对照,模型组和益气解毒方组小鼠使用1.0 Gy 60Coγ射线对其进行一次性全身照射。空白组和模型组小鼠在照前7 d至照后35 d灌胃去离子水,益气解毒方组小鼠灌胃益气解毒方药液。照后第36d,按雄雌比1:2的比例,将每只雄性Balb/c小鼠与雌性Balb/c小鼠合笼,合笼五周,每日早上8点、下午5点检查雌鼠阴道栓,通过称量体质量的辅助手段将确定怀孕的雌鼠隔离,单笼饲养。雄性小鼠在照后第70 d处死并取材,记录雄性小鼠的体质量变化、睾丸、附睾系数以及精液常规指标,子代小鼠出生后观察至42日龄处死,记录雌鼠的受孕率、平均窝仔数以及子代小鼠的体质量变化。实验二:将72只雄性Balb/c小鼠根据体质量按随机数字表法随机分成空白组、模型组、安多霖组和益气解毒方组。空白组小鼠进行假照射作为空白对照,模型组、安多霖组和益气解毒方组小鼠使用2.0 Gy 60Coy射线对其进行一次性全身照射。空白组和模型组小鼠在照前7 d至照后35 d灌胃去离子水,安多霖组和益气解毒方组小鼠分别灌胃安多霖混悬液和益气解毒方药液。照后第36d,按雄雌比1:2的比例,将每只雄性Balb/c小鼠与雌性Balb/c小鼠合笼,合笼五周,每日早上8点、下午5点检查雌鼠阴道栓,通过称量体质量的辅助手段将确定怀孕的雌鼠隔离,单笼饲养。雄性小鼠分别在照后第35 d、70 d处死并取材,检测雄性小鼠的睾丸和附睾系数、睾丸和附睾的超微结构变化、全血细胞计数以及精液常规指标,子代小鼠出生后观察至第42日龄处死,记录雌鼠的受孕率、平均窝仔数、子代小鼠的性别比例、体质量变化、全血细胞计数以及血液生化变化情况。实验三:检测实验二中取材的小鼠精子的ATP含量、精子膜电位变化、精子TLR5、MyD88、IRAK4、PI3K、GSK-3α的表达变化情况以及小鼠睾丸中TLR5、GSK-3 α的表达变化情况。结果理论研究:(1)“肾主生殖”的功能基础是基于中医藏象学说中的“肾藏精”理论。其中,“肾藏精”主要体现为肾具有封藏之性,可藏先、后天之精及脏腑之精。(2)“肾主生殖”主要体现在两点,其一是肾与男子生殖器官关系密切,肾可通过经脉络属统领男子阴器,且肾开窍于前阴。其二是肾可通过调节肾中精气进而调节人体生殖功能。(3)男子生殖之精与肾精的功能、储藏部位均不同。肾精藏于肾,除濡养并维持本脏腑的生理功能以外,还可作为化生男子生殖之精的物质基础。而男子生殖之精藏于精室,有繁殖作用,可排出体外与女子生殖之精结合成胎。(4)对胎孕而言,胎孕的形成是以男子生殖之精与女子生殖之精互相交结而成,因此,男子生殖之精的健康是形成胎孕的必要因素,其异常会导致胎儿的禀赋不足。实验研究:实验一:1.0 Gy 60Co γ射线可以迅速降低雄性Balb/c小鼠体质量,而在照射前后给予小鼠益气解毒方可促进小鼠体质量恢复。同时,照后70 d小鼠的精子质量以及与之交配的雌鼠的窝仔数仍未恢复至空白组水平,而益气解毒方的防治有效地改善了以上情况。实验二:小鼠受一次性全身照射2.0 Gy 60Co γ射线后,小鼠在照后35 d时的睾丸、附睾系数、精子质量、睾丸和附睾的超微结构以及全血细胞计数均严重受损。至照后70 d雄性小鼠的精子浓度和全血细胞计数已经恢复,但精子活力及活率仍未恢复。子代小鼠方面,模型组子代小鼠窝仔数显著下降、白细胞和淋巴细胞显著升高,提示子代小鼠受亲代精子质量下降所影响而发育缓慢,而益气解毒方的防治有效地改善了以上情况。实验三:照后35 d、70 d,照射各组小鼠精子线粒体膜电位及精子ATP含量下降,安多霖和益气解毒方有效改善了照后35 d小鼠精子膜电位的损伤。照后35 d模型组小鼠的TLR5、MyD88、IRAK4、PI3K和GSK-3α的表达显著上升,而益气解毒方下调了TLR5等各因子在精子上的表达。在睾丸中,模型组TLR5的表达比空白组显著下降,给药组与空白组相比无显著差异。结论:理论研究:“肾主生殖”的功能基础是基于“肾藏精”的功能,而肾所藏之肾精与男子生殖之精具有互根互用的关系。同时,胎孕与男子生殖之精密切相关,男子生殖之精的充盈是优生优育的必要条件。由此可见,我们可以通过调养肾精达到滋补生殖之精的作用。所以,基于优生优育的基本原则及肾为封藏之本的特性。我们要以预防为主,重视对肾的调养,不宜妄泻肾精,并在计划求子之前做必要的相关检查,以保证良好的胚胎质量。实验研究:本次实验复制了课题组前期的睾丸辐射损伤模型,进而观察到电离辐射对雄性小鼠生育功能的损伤,而在照射前后均给予益气解毒方对雄性小鼠生育功能的损伤是起到了良好的防治效果。同时,我们观察到2 Gy 60Co γ射线能够激活小鼠精子上TLR5以及下游信号因子GSK-3 α的表达这可能是电离辐射导致精子活力下降的主要原因之一,而益气解毒方可通过抑制精子上TLR5以及下游因子GSK-3 α的表达改善了小鼠的精子活力。此外,2 Gy 60Co γ射线抑制了睾丸中TLR5的表达,而对GSK-3 α并无明显调控作用,其中的具体机制仍需进一步探讨。