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苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)产生的Cry毒素与4类受体互作而高效、高选择性地杀死靶标害虫。目前,已大面积种植多种转Bt作物。在我国,商业化种植的主要是转Cry1A毒素的棉花,这虽能有效控制靶标害虫棉铃虫的为害,但甜菜夜蛾等许多非靶标昆虫由于对CrylA毒素的耐受性高,因而可能上升为棉田主要害虫。Cry1C和Cry1A序列的相似性低。甜菜夜蛾对Cry1Ca的敏感性高,是防治甜菜夜蛾的理想毒素。但Cry1Ca受体蛋白的研究较少。本文发现甜菜夜蛾体内四类受体蛋白碱性磷酸酯酶(ALP)、氨肽酶N(APN).ABC转运蛋白(ABCC2)和钙粘蛋白(Cad)均与Cry1Ca相互作用,RNA干扰这4类受体均降低了试虫的敏感性。1.膜结合型碱性磷酸酯酶基因的克隆及其与Cry1Ca的相互作用克隆了5条膜结合型SeALP。这5条SeALP具有相似的结构特点：N端信号肽、3个底物结合位点、10个Zn2+和Mg2+结合位点以及C端的GPI锚定序列。这5条SeALP在幼虫期的表达量高,在蛹期和成虫期以及在不同组织中则因种类而不同。大肠杆菌表达出的无信号肽和锚定序列的SeALP多肽片段均与Cry1Ca的结合能力强,而与Cry1Ac的结合能力弱。分别用SeALP1-、SeALP2-、SeALP3-、SeALP4-和SeALP5-dsRNA连续喂食初孵幼虫4天后,其靶标基因表达量分别下降了58.9%、40.0%、64.7%、48.3%和68.7%。当喂食dsSeALP的幼虫再用含有Cry1Ca勺人工饲料喂食6天后,幼虫的死亡率分别是49.1%、54.9%、65.3%、52.5%和77.4%。喂食dsSeALP1、dsSeALP2或SeALP4的幼虫死亡率显著低于喂食PBS、dsegfp、dsSeALP2或dsSeALP5的幼虫的死亡率。因此,SeALP1、SeALP2和SeALP4可能是甜菜夜蛾幼虫中Cry1Ca的受体。2.氨肽酶N基因的克隆及RNAi对Cry1Ca敏感性的影响克隆出2条SeAPN,并搜寻到4条已公布序列。6条SeAPN分别属于6个类群。所有的SeAPN有相似的结构特点：N端信号肽、谷氨酸锌化氨肽酶基序、锌结合/谷氨酸锌化基序"HEXXH(X)18E"以及C端的GPI锚定序列。6条SeAPN均在幼虫期表达量高,尤其是在幼虫中肠、前肠和后肠。分别用SeAPN1、SeAPN2、SeAPN3、 SeAPN4、SeAPN5和SeAPN6的dsRNA连续喂食初孵幼虫4天后,其靶标基因的表达量分别下降了55.6%、45.5%、43.2%、56.8%、45.4%和46.0%。当喂食dsSeAPN的幼虫再用含有Cry1Ca的人工饲料喂食6天后,幼虫的死亡率分别是52.0%、77.2%、43.3%、62.0%、65.4%和53.8%。喂食dsSeAPN1、dsSeAPN3或dsSeAPN6的幼虫的死亡率显著低于喂食PBS、dsegfp、dsSeAPN2、dsSeAPN4或dsSeAPN5的幼虫的死亡率。因此,推测甜菜夜蛾幼虫SeAPN1、SeAPN3和SeAPN6是Cry1Ca的候选受体。3.甜菜夜蛾ABCC2基因的克隆及其与CrylCa的相互作用利用简并引物从甜菜夜蛾幼虫中肠成功分离得到SeABCC2。它由4个功能结构域组成：2个跨膜结构域(TMD)和2个核苷酸结合结构域(NBD)。该基因在幼虫期的表达量高,尤其是在中肠、前肠和后肠。在Sf9细胞中异源表达SeABCC2后,发现细胞对Cry1Ca的肿胀率从7.4%上升到28.5%。甜菜夜蛾喂食大肠杆菌发酵的SeABCC2-dsRNA,靶标基因的转录水平下降了58.2%,幼虫对Cry1Ca勺死亡率从79.4%下降到49.0%。因此,实验结果表明甜菜夜蛾幼虫SeABCC2是Cry1Ca的潜在受体。4.甜菜夜蛾钙粘蛋白与CrylCa的相互作用大肠杆菌表达得到了具有潜在毒素结合位点的甜菜夜蛾钙粘蛋白片段(rSeCad1bp)和棉铃虫钙粘蛋白片段(rHaBtRp)。竞争结合分析显示Cry1Ca和Cry1Ac都可以与rSeCadlbp和rHaBtRp结合,但两种毒素不相互竞争。Sf9细胞中表达SeCad1b后,细胞对Cry1Ca的肿胀率从7.4%上升到47.1%，所以表达SeCadlb的Sf9细胞增加了对Cry1Ca勺敏感性。甜菜夜蛾喂食大肠杆菌发酵的SeCad1b-dsRNA后,SeCad1b勺转录水平下降了80.2%,对Cry1Ca的死亡率从83.0%下降到52.1%。因此,实验结果表明甜菜夜蛾SeCad1b是Cry1Ca的潜在受体。本文的实验结果表明,甜菜夜蛾体内可能存在与CrylA同样的四类受体蛋白：ALP、APN、ABCC2和Cad,而且它们可能是Cry1Ca 6勺受体,介导Cry1Ca对甜菜夜蛾的毒性。本论文的研究结果为改进抗性治理策略以及Cry1Ca的田间应用奠定了基础。