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本试验旨在研究水貂生长激素的克隆与表达,探索出批量生产的途径和方法。试验通过构建真核表达质粒pPIC9K-mGH,转化到巴斯德毕赤酵母GS115,利用含不同浓度G418(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/ml)的YPD平板进一步筛选多拷贝重组子。将多拷贝重组子用BMGY富集菌株,并用BMMY诱导表达蛋白,每隔24h取样一次并添加甲醇,使其终浓度为1%。将取得的菌样,离心取上清,TCA浓缩并进行SDS-PAGE和Western blot检测;通过构建真核表达质粒pVAX1-mGH,利用Lipofectamine TM 2000转染到BHK-21细胞中,用最小致死量为300μg/ml的G418进行阳性细胞株的筛选,进行免疫细胞化学和ELISA检测蛋白表达情况。本试验还将阳性重组质粒pVAX1-mGH注射到小鼠后肢的股四头肌,分别于注射后5、10、20、40、60d眼球采血,ELISA检测血清中mGH的含量,同时取注射部位的肌肉组织进行免疫组织化学检测。试验结果如下:
1.重组质粒pPIC9K-mGH转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,经含4.00 mg/mlG418的YPD平板筛选出高拷贝细胞株,用SDS-PAGE检测mGH的表达。结果显示,用1%甲醇连续诱导3d后,目的蛋白的表达最多;Western blot鉴定表明目的蛋白在酵母中获得了表达。
2.重组质粒pVAX1-mGH转染到哺乳动物BHK-21细胞中,经G418筛选出阳性细胞株,免疫组化检测到目的蛋白在BHK-21细胞中获得了表达;ELISA检测到目的蛋白具有较好的免疫原性,且转染后48h,目的蛋白的表达量最多。
3.重组质粒pVAX1-mGH注射到小鼠后肢的股四头肌后40d,血清中目的蛋白的含量最多,且ELISA检测到目的蛋白具有较好的免疫原性。免疫组织化学检测到了特异性的目的蛋白,说明mGH在小鼠的肌纤维中得到了表达。