论文部分内容阅读
F-box蛋白是组成SCF复合体的一个重要成分，通过特异性识别和结合底物，介导底物通过泛素化降解途径降解。该蛋白家族在植物生长发育过程中具有重要调控作用。我们实验室前期研究发现，F-box蛋白FOF2调控植物开花。采用生物信息学分析 FOF2基因的启动子，发现启动子中含有多个非生物胁迫反应调控元件，因此推测 FOF2可能参与调控植物非生物胁迫响应。本研究通过分析不同逆境胁迫对FOF2基因表达的影响，FOF2过量表达或缺失对植物抗逆境胁迫的影响，以及FOF2靶蛋白筛选和相互作用验证，系统研究了FOF2在植物抗逆境胁迫的响应中的功能及作用机制。 1.首先利用生物信息学GPS-SUMO方法发现：FOF2蛋白存在多个潜在泛素化位点；实时荧光定量 PCR分析表明：FOF2基因表达受到了 ABA、干旱、NaCl和冷的诱导。 2.干旱胁迫处理，过表达株系(MycFOF2ox1、MycFOF2ox2、MycFOF2ox6)的抗旱能力明显强于野生型（Col-4），而功能缺失突变体（fof2）则比野生型（Col-0）弱；外源ABA处理，过表达株系或缺失突变体分别与野生型（Col-4/Col-0）相比，在主根伸长、种子萌发、气孔开度、失水率、SOD、电解质渗透比和脯氨酸含量方面都存在显著性差异。 3.干旱处理后，定量分析了干旱相关基因RAB18、RD22和CBF4表达量,结果表明:过表达株系高于野生型（Col-4），而缺失突变体低于野生型（Col-0）；在盐胁迫处理后，定量分析了盐胁迫相关基因SOS1、SOS2和SOS3，结果表明：过表达株系低于野生型（Col-4），而缺失突变体高于野生型（Col-0）;冷胁迫处理后，定量分析了冷相关基因 CBF1、CBF3和 COR15a的表达，结果显示：过表达株系高于野生型（Col-4），而缺失突变低于体野生型（Col-0）。 4.为了验证FOF2提升抗旱的能力与F-box结构域的关系，定量检测了RAB18、RD22和 CBF4在转基因株系(FOF2△F-10，FOF2△F-51)与野生型（Col-4）中表达，以及外源ABA处理后主根长度和种子萌发率的统计,结果均表明：FOF2△F低于野生型（Col-4）。 5.通过酵母双杂交，筛选到 FOF2的互作蛋白 VOZ1和 VOZ2，并通过 BiFC和Co-IP的方法证实FOF2与VOZ1和VOZ2互作。为了探究FOF2和VOZs的关系，通过泛素化实验分析：在烟草体系中表达Myc-FOF2和VOZ2-Flag，VOZ2-Flag蛋白可被FOF2加剧泛素化；通过半体外降解实验分析：内源FOF2蛋白能够加速原核表达VOZ2蛋白的降解且受MG132的抑制，说明FOF2参与了VOZ2的泛素化降解过程。 6.通过遗传杂交的方法，获得了voz1/2/fof2三杂突变体。在干旱处理后，检测了fof2、voz1/2和voz1/2/fof2突变体抗干旱表型；在ABA处理后，测定了种子萌发及主根伸长；与此同时，还测定干旱胁迫基因RAB18、RD22和CBF4的表达，均发现三突变体 voz1/2/fof2表现为双突变体 voz1/2的表型，表明在植物抗干旱胁迫响应通路中FOF2位于VOZ1/2上游。 综上所述，拟南芥FOF2蛋白通过调控VOZs蛋白水平来影响植株抗非生物胁迫的能力。