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目的本研究旨在构建人FcγRIIb基因的真核表达重组质粒pEGFP-FcγRIIb,并检测其在真核细胞NIH3T3及BALB/c小鼠体内的表达,为后续的体内研究奠定基础。方法提取U937细胞的总RNA,采用RT-PCR法扩增人FcγRIIb基因编码区片段。用限制性内切酶HindⅢ和SmaⅠ双酶切空质粒pEGFP-C1获得线性化质粒。将扩增出的目的片段与线性质粒pEGFP-C1连接,构建重组表达质粒pEGFP-FcγRIIb,经PCR、限制性核酸内切酶酶切及DNA测序鉴定后,采用脂质体法将重组表达质粒pEGFP-FcγRIIb转染到真核细胞NIH3T3中,同时设空质粒pEGFP-C1和细胞对照组,用荧光显微镜观察细胞瞬时表达。经G418筛选3W,荧光显微镜下观察阳性细胞约为80%时,提取细胞的总蛋白,用Western blot方法进一步鉴定人的FcγRIIB的表达情况。将重组质粒pEGFP-FcγRIIb注射到BALB/c小鼠肌肉中,并设空质粒pEGFP-C1和PBS对照组。三组小鼠分别注射pEGFP-FcγRIIb(50μg)、pEGFP-C1(50μg)及PBS(50μL),2w后以相同剂量的质粒和PBS在相同部位加强注射一次。再隔2W,断颈处死小鼠,取肌肉组织,用Western blot及免疫组织化学染色技术检测人的FcγRIIB的表达情况。结果(1)利用RT-PCR法扩增出了人的FcγRIIb编码区片段,大小为933bp。(2)重组质粒pEGFP-FcγRIIb进行PCR扩增后,得到一条约930bp的片带;用限制性内切酶HindⅢ对其进行单酶切分析,得到一条约5630bp的片段;用HindⅢ和SmaⅠ双酶切分析,同一泳道出现约4700bp和930bp两个酶切片段,分别与空质粒pEGFP-C1和FcγRIIb单酶切片段大小一致;测序结果提交GeneBank进行Blast比对分析,同源性为99%,插入片段的大小、方向均与设计的一致,表明成功构建了重组表达质粒pEGFP-FcγRIIb。(3)重组质粒pEGFP-FcγRIIb转染NIH3T3细胞后,用荧光显微镜观察:转染细胞内有较强的绿色荧光,主要表达在细胞膜与细胞内;空质粒pEGFP-C1和细胞对照组的细胞内均未见绿色荧光,表明重组质粒pEGFP-FcγRIIb成功转入NIH3T3细胞,并在该细胞中得到了瞬时表达。(4)用Western Blot检测转染重组质粒pEGFP-FcγRIIb的NIH3T3细胞上表达了人的FcγRIIB,分子量约为37KDa,而转染空质粒pEGFP-C1及细胞对照组的细胞内均未见表达。(5)用Western Blot及免疫组织化学染色技术检测注射重组质粒pEGFP-FcγRIIb的小鼠体内成功表达了人的FcγRIIB,分子量约为37kDa,而注射空质粒pEGFP-C1及PBS的小鼠体内未见表达。结论成功构建了真核表达质粒pEGFP-FcγRIIb,将其转染到真核细胞NIH3T3后,获得了瞬时和稳定表达;将重组质粒注射到BALB/c小鼠肌肉中,成功表达了人的FcγRIIB,为进一步研究FcγRIIB的生物学功能奠定了基础。