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研究背景化疗作为目前临床上大多数恶性肿瘤的主要治疗方法之一,在治疗中常产生化疗抵抗（或称耐药）,造成治疗失败。其中一个重要的抵抗机制是肿瘤的血供不足,造成肿瘤内释药不足。目前临床上对于乏血供肿瘤化疗抵抗的问题尚无实际有效的解决方法。前期研究发现,机械指数（mechanical index,MI）低于0.3的低强度超声激励微泡空化可暂时性增加肿瘤的局部血流灌注,这或许可以改善肿瘤的乏血供状态,但尚未进行进一步的研究。本实验拟通过建立SD大鼠的Walker-256皮下肿瘤模型,研究低机械指数条件下,不同MI及脉冲重复频率（pulse repetition frequency,PRF）对肿瘤血流增强的影响。并进一步研究乏血供肿瘤血流灌注增强的可能作用机制,最终验证该方法提高肿瘤局部化疗药物浓度的可行性。研究目的1.通过调控机械指数（MI）和脉冲重复频率（PRF）,研究诊断超声的不同治疗参数对增强乏血供肿瘤血流灌注的影响。2.进一步研究乏血供肿瘤血流灌注增强的可能作用机制。3.验证肿瘤化疗药物浓度进一步提高的可行性。材料和方法1.实验仪器VINNO 70超声诊断仪（飞依诺,苏州）,X4-12L高频线阵探头（频率4～12 MHz）。2.实验试剂示卓安（GE HEALTHCARE AS,挪威）,全氟丁烷微球,在超声造影时用,用4 m L无菌生理盐水复溶,微泡浓度约6×108/m L,平均直径为2.1μm。声诺维（Bracco Suisse SA,意大利）,六氟化硫微泡,在治疗时用,用5 m L无菌生理盐水复溶,微气泡浓度约（1～5）×108/m L,平均直径为2.5μm。盐酸阿霉素（美仑,大连）3.实验动物8周龄SD大鼠81只,体重180～220 g。4.实验方法4.1建立模型:将Walker-256肿瘤细胞进行培养、将细胞浓度调整至约1×107/m L。随机选择大鼠的一侧大腿,进行备皮、消毒,取0.2 m L肿瘤细胞悬液注入内侧皮下。4.2分组和处理:4.2.1超声治疗:将56只大鼠肿瘤模型随机分为7组,每组8只。腹腔注射麻醉大鼠后,建立尾静脉通道。用常规二维超声观察肿瘤的大小,并将探头固定于肿瘤直径最大的切面。将0.04 m L全氟丁烷微球溶液经尾静脉团注,用以治疗前造影,待造影剂基本廓清后,切换至Vflash空化治疗模式。固定的治疗参数有:频率4 MHz,每个脉冲长度10.5个周期,脉冲/间歇时间1.0 s/1.0 s,本研究需要调控的参数为机械指数（MI）、脉冲重复频率（PRF）,其中:Control组超声假照、A组MI=0.25 PRF=50 Hz、B组MI=0.25PRF=1.0 kHz、C组MI=0.25 PRF=2.0 kHz、D组MI=0.30 PRF=50 Hz、E组MI=0.30PRF=1.0 kHz、F组MI=0.30 PRF=2.0 kHz。治疗中缓慢匀速注射0.4 m L六氟化硫微泡溶液,总治疗时间10 min。超声辐照结束后的即刻及4 h后分别进行超声造影。4.2.2测定MI对应的实际峰值负压:用薄膜水听器测量该超声诊断仪在频率=4MHz、MI=0.25、0.30时对应的实际峰值负压。4.2.3机制研究:超声治疗后4 h,根据肿瘤血流效应的实验结果,直接剥离Control组、B组MI=0.25 PRF=1.0 kHz、E组MI=0.30 PRF=1.0 kHz的肿瘤组织,分别使用相应试剂盒测定肿瘤组织内ATP、e NOS、NO、PGE2、PGD2、PGF2、PGI2、C3a、C5a、LTC4、TNF-α、HIF-1α、ROS的含量。4.2.4阿霉素（Doxorubicin,DOX）药物浓度测定:建立大鼠肿瘤模型25只,根据前期实验结果,随机分为2组:Control组11只,Treated组（MI=0.25 PRF=1.0 kHz）14只。Control组行超声假照,Treated组经超声联合微泡治疗10 min,于超声辐照前、辐照后即刻、4 h分别行造影检查,于超声辐照后的约3 h 20 min经尾静脉缓慢推注阿霉素溶液,浓度为10 mg/kg,于治疗后4 h剥离肿瘤,每组各取部分肿瘤组织,用高效液相色谱测定瘤内阿霉素含量。4.2.5组织学检查:于治疗后4 h剥离肿瘤组织,每组各取4个,行CD31免疫组织化学染色,并观察肿瘤组织中DOX的荧光漏出情况。另每组各取1个,进行HE染色。结果1.超声肿瘤血流效应治疗后即刻,B、E组的PI、AUC值、肿瘤血流灌注面积较治疗前增加（均P<0.05）;在治疗后4 h,B组PI、AUC值、肿瘤血流灌注面积持续增加,优于治疗后即刻（均P<0.05）,而其余各组的PI、AUC值相对于治疗后即刻减少（其中Control组P<0.05,余均P>0.05）,肿瘤血流灌注面积亦相对于治疗后即刻减少（其中Control组、F组P<0.05,余均P>0.05）。2.峰值负压声学测量实际测量VINNO 70超声诊断仪的X4-12L探头在频率4 MHz、MI=0.25、0.30,在距离探头表面约2 cm时的峰值负压,MI=0.25的平均峰值负压为（0.26±0.01）MPa,MI=0.30为（0.32±0.01）MPa。3.机制研究治疗后4 h,B组MI=0.25 PRF=1.0 kHz肿瘤组织的ATP、e NOS、NO、PGF2、PGI2、C5a、LTC4、TNF-α、ROS含量均高于Control组（均P<0.05）;E组MI=0.30 PRF=1.0kHz肿瘤组织的PGF2、C5a、LTC4、TNF-α、ROS含量均高于Control组（均P<0.05）;B组MI=0.25 PRF=1.0 kHz肿瘤组织的HIF-1α、PGE2、PGD2、C3a含量均高于Control组,但无统计学意义（均P>0.05）。4.DOX药物浓度治疗后4 h,Control组的阿霉素药物浓度为（1152.71±369.83）ng/g,Treated组的阿霉素药物浓度为（3246.59±1301.85）ng/g,差异有统计学意义（P<0.05）。Treated组的阿霉素药物浓度为Control组的2.82倍。镜下观察,Treated组的DOX荧光强度明显高于Control组,且分布更广、更均匀。5.组织学检查治疗后4h,Treated组的CD31的表达水平较Control组低。病理检查Treated组可见微血管充血。结论1.MI=0.25、PRF=1.0 kHz的低强度诊断超声激励微泡空化可产生较明显的肿瘤血流增强效应,且持续4 h以上。2.MI=0.25对应的实际测量平均峰值负压为（0.26±0.01）MPa,MI=0.30为（0.32±0.01）MPa。3.超声肿瘤血流增强效应可能与空化引起的无菌性炎症反应、ATP的释放以及NO、前列腺素的产生有关。4.肿瘤血流增强可提高肿瘤局部阿霉素（DOX）的药物浓度。