胰蛋白酶(EC3．4．21．4)属于丝氨酸家族，是昆虫中肠内的一种主要的碱性蛋白质水解酶。本实验室前期研究表明，杠柳新苷T和P在活体条件下能激活粘虫中肠胰蛋白酶，激活倍数高达3.78倍。但对分离纯化的粘虫中肠胰蛋白酶没有明显激活作用，且无浓度依赖性，为了进一步证实杠柳新苷T和P是否直接作用粘虫中肠胰蛋白酶，本文运用RACE技术克隆了粘虫中肠胰蛋白酶的基因，并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列以及预测的蛋白质高级结构进行了分析，在构建粘虫胰蛋白酶的原核表达载体基础上，研究了杠柳新苷类化合物对表达纯化的粘虫中肠胰蛋白酶活性的影响。主要研究结果如下：1．粘虫中肠胰蛋自酶基因全长cDNA序列在对多种夜蛾科昆虫的胰蛋白酶基因进行了多重比对后设计了3条特异性中间片段引物，以来自粘虫中肠的mRNA为模扳扩增得到了粘虫中肠胰蛋白酶中间片段的序列。根据得到的中间片段的序列设计了4条特异性3’ RACE引物和4条5’ RACE特异性引物，从而得到了粘虫中肠胰蛋白酶的3’端序列和5’端序列。分别从得到的3’端序列和5’端序列设计特异性引物扩增粘虫中肠胰蛋白酶全长cDNA。从粘虫中肠总RNA中扩增得到的胰蛋白酶全序列为933bp，包括5’端非编码区(untranslation region,UTR)81bp，蛋白质编码区765bp，3’端非编码区88bp。2．粘虫中肠胰蛋白酶原基因推导氨基酸序列的分析粘虫中肠胰蛋白酶基因开放阅读框编码255个氨基酸，包括16个氨基酸的信号肽。所得序列具有丝氨酸蛋白酶的保守序列：(1)含有保守的His(H96)、Asp(D141)和Set(S238)活性三联体，并且在催化位点附近的Asp（D237）、Gly(G255）、Gly（G265）等也都很保守。(2)具有典型的保守的底物结合位点Asp(D232)，该残基位于底物结合沟的底部，并通过电荷作用而稳定底物裂解位点的Lys或Arg残基，因而也决定着胰蛋白酶的专一性。（3）胰蛋白酶N末端的氨基酸序列lie-Val-Gly-Gly。(4)具有4个(二硫键。其基因基本结构和从其它昆虫中克隆的胰蛋白酶的基因结构一致。3．粘虫中肠胰蛋白酶基因的同源性分析粘虫中肠胰蛋白酶的氨基酸序列与许多昆虫的胰蛋白酶基因具有较强的相似性。尤其是底物作用位点和活性三联体是完全保守的。除此之外在底物作用位点附近的一些氧基酸残基也具有比较高的保守性，还有丝氮酸家族特有的组成3个二硫键的6个半胱氨酸残基在所有真核动物中都是保守的，脊椎动物中一般都有4个二硫键，这些位点的氨基酸残基也非常保守。4.粘虫中肠胰蛋白酶的原核表达将粘虫胰蛋白酶基因的开放读码框定向克隆到pET-28a载体上，构建原核表达载体,胰蛋白酶基因的编码蛋白在大肠杆菌中得以成功表达，分子量大约为27kD，经过纯化得到较纯的酶。5.杠柳新苷类化合物对原核表达胰蛋白酶活性的影响以BNpNA为特异性底物，测定了纯化后的原核表达的胰蛋白酶的活性分别为1.8375μmol/min﹒mg pro。无杀虫活性的杠柳新苷E对纯化后的粘虫类胰蛋白酶没有明显影响，也无浓度依赖性。高浓度的具杀虫活性的杠柳新苷P和T对表达纯化的粘虫类胰蛋白酶有激活作用，但也没有浓度依赖性。因此，我们认为杠柳新苷P和T对离体的的粘虫胰蛋白酶无明显激活作用，推测杠柳新苷类化合物经粘虫取食后，可能作用于胰蛋白酶的转录和翻译环节，通过影响胰蛋白酶的表达和分泌，使胰蛋白酶表现出高活性，进而影响其正常代谢致粘虫死亡。