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在植物生长发育和环境适应过程中,Ca2+作为重要的胞内第二信使,对胞内外不同信号或刺激会形成时空特异性的Ca2+信号,触发植物对各种生物或非生物胁迫的响应。类钙调磷酸酶B亚基蛋白(CBLs)是最近几年中备受关注的Ca2+感受器,它能识别并解码Ca2+信号,在植物逆境响应、营养物质吸收中起着重要调控作用。然而,CBLs自身并没有具备激酶活性,必须通过与其互作蛋白激酶CIPKs互作构成CBL-CIPK信号系统才能发挥其生物学功能。已知CBL-CIPK信号系统是植物逆境响应中的主要信号途径,参与调控多种逆境胁迫响应。因而,成为近几年植物逆境胁迫生理与分子生物学研究领域中的重要热点之一。青藏高原一年生野生大麦(Hordeum spontaneum C.Koch)是国宝级禾本科野生资源。由于其长期生长在各种极端恶劣环境下,经过漫长的自然进化,形成了与之相适应的独特的抗(耐)性基因网络,含有丰富的等位基因变异位点。因此,分离和克隆野生大麦HsCIPKs基因对作物耐逆境遗传改良具有重要应用价值,但至今仍没有被开发利用。本研究采用反向遗传学研究策略,利用分子克隆、转基因等现代分子生物学技术和生理生化等分析手段从青藏高原一年生野生大麦中分离和克隆HsCIPKs基因,并在水稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica cv.Nipponbare)中进行抗逆性功能验证,期望获得高耐逆境转基因水稻株系,初步阐明HsCIPKs的作用机理,为高耐逆境水稻品种的培育提供中间材料。主要研究结果如下:1.利用分子克隆技术,从野生大麦的总cDNA中,成功克隆到4个HsCIPKs(17,24,29和31)基因的全长编码序列,并构建4个相应过表达载体。另外,本实验室前期研究工作中,已成功克隆8个HsCIPKs基因及其相应过表达载体。2.利用农杆菌介导法和水稻日本晴成熟胚转基因体系,将上述12个过表达载体分别导入水稻日本晴愈伤组织中,获得转基因再生植株。经RT-PCR分析表明,各表达载体均获得至少2个以上的T1代高表达转基因株系。经两代繁殖后,通过抗性(G418)筛选,获得T3代水稻转基因纯合株系。3.利用水稻初生根相对伸长率来分析HsCIPKs基因对各种逆境胁迫处理的耐/抗性。分析结果表明,与非转基因对照株系相比,HsCIPK2、HsCIPK5、HsCIPK17、HsCIPK28、HsCIPK29和HsCIPK30显著性地提高了转基因株系对高盐胁迫的耐/抗性;HsCIPK和HsCIPK17明显促进转基因株系对ABA的抗性;HsCIPK9、HsCIPK1 1、HsCIPK14、HsCIPK17、HsCIPK23、HsCIPK24 和 HsCIPK29基因显著增强了转基因植株对CdC12的耐/抗性;HsCIPK2、HsCIPK5、HsCIPK9、HsCIPK17和HsCIPK30转基因株系对K2Cr2O7胁迫表现出明显的耐/抗性;HsCIPK2、HsCIPK14和HsCIPK17基因显著降低了转基因植株对HgC12的敏感性;同样,HsCIPK5、HsCIPK24、HsCIPK29和HsCIPK31显著增强了转基因植株对CuSO4的耐/抗性;此外,过表达.HsCIPK17、HsCIPK23、HsCIPK29和HsCIPK31显著提高了转基因植株对干旱胁迫的耐/抗能力。这些结果证实,过表.达HsCIPKs能够显著提高转基因植株的耐/抗逆性,表明青藏高原野生大麦HsCIPKs基因参与调控多种非生物胁迫的响应。