研究背景高泌乳素血症(Hyperprolactinemia, HPRL)是由下丘脑—垂体—性腺轴功能紊乱引起的一种常见病、多发病,当血清泌乳素(Prolactin, PRL)水平持续高于正常水平时,临床上一般定义为HPRL。该病多发于女性,当发生垂体肿瘤、原发性甲状腺功能减退、肾功能衰竭、妇产科手术、创伤或长期服用干扰多巴胺合成、代谢或阻断多巴胺受体药物、激素类药物(抗精神病药物、止吐剂、雌激素等),特别在给予抗精神病药物治疗后,均可促使PRL分泌,引发HPRL。当血清PRL水平异常升高时,扰乱了下丘脑-垂体-性腺轴功能,抑制下丘脑分泌促性腺激素释放激素(GnRH),从而促卵泡生成激素(FSH)和黄体生成激素(LH)分泌减少,引起卵泡发育不良、排卵功能异常和黄体功能不足,引发生殖障碍、月经失调、不孕不育、性功能下降、乳房疾病、性腺机能减退、骨质疏松以及自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮和风湿性关节炎等疾病。因此,治疗HPRL应以降低PRL水平为目的,恢复正常生殖系统和性腺功能。目前可从外科手术切除或放射治疗垂体肿瘤、口服多巴胺受体激动药物、中药等多方面着手。近年来随着中医药研究的快速发展及中药多靶点、低毒性、易顺应等优点的日益突显,以及针对HPRL西药治疗的副作用大、费用高、停药易复发等缺陷,愈来愈多科研工作者开始运用传统中医理论,对该病症进行辨证论治,取得了满意疗效,不仅可减少副反应发生,而且经济实惠。目前国内外尚未见治疗HPRL的中药制剂上市,若根据HPRL发病机制,结合我国传统中医药学理论,开展应用中药复方制剂对HPRL的基础与临床研究,开发出疗效稳定、副作用小的中药制剂,并完善其药效评价系统,不仅能对HPRL的临床治疗提供帮助,更能维护患者的经济利益,并获得良好的社会效益。本课题组于2001年开始从事HPRL的防治工作,在十余年系统的临床与应用研究基础上,研制出用于治疗HPRL的纯中药制剂——抑乳调经颗粒(YiruTiaojing Granule, YRTJ),处方由仙茅、巴戟天、白芍及甘草等四味中药组成,具有补肾和血、舒肝柔肝之功效。本课题将对该处方从质量标准、长期毒性、药效学及药理学作用机制等方面进行系统研究与评价,为下一步临床实验研究奠定基础。目的优化YRTJ质量标准,提高制剂质量控制方法；考察处方加速条件下制剂的稳定性,初步预测样品在规定的贮存条件下长时间内的稳定性；观察长期给药后对大鼠所产生的慢性毒性反应及严重程度,提供毒副反应的靶器官及停药后的恢复和发展情况；构建HPRL动物模型,评价其药效,探讨其药理学作用机制,为下一步临床试验奠定基础。方法1YRTJ质量标准研究1.1.定性鉴别：采用薄层色谱法(TLC)定性鉴别处方中白芍、巴戟天和甘草三味中药。1.2.含量测定：采用高效液相色谱法(HPLC)对芍药苷进行定量检测。色谱条件：流动相为乙腈：0.1%磷酸溶液=14：86；检测波长230nm；流速：1.0mL/min;色谱柱：美国迪马公司钻石色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);柱温：30-C。在此条件下进行线性范围考察、系统适应性试验、精密度试验、回收率试验、稳定性试验与样品测定。2YRTJ加速稳定性研究参照本制剂质量标准和《中国药典》2010版要求,市售包装供试品在温度40℃±2℃,相对湿度75%±5%条件下放置,在试验期间第0、1、2、3、6个月末各取样一次,按规定项目考察形状、粒度、鉴别试验以及芍药苷的含量测定。3YRTJ长期毒性试验按国家中药、天然药物注册分类申报资料要求,将60只SD雌性大鼠随机分为正常对照组和YRTJ高、中、低剂量组,剂量分别为临床用药剂量的100、50、25倍,每日灌胃给药,试验周期60d。在最后一次给药24h后,各组随机抽取8只大鼠并处死,分别测定血液学和血液生化学指标,并对各器官进行病理学检查,剩余大鼠继续观察14d后处死,重复上述各项检查。4YRTJ药效学研究4.1.实验性HPRL动物模型研究分别考察垂体移植术、己烯雌酚给药等方法,以及甲氧氯普胺不同剂量与给药次数法等模型制备方法的优劣,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中PRL水平及持续时间为标准,筛选得到最佳模型制备方法。4.2.药效学考察用连续腹腔注射多巴胺受体阻断剂(盐酸甲氧氯普胺注射液)制备大鼠HPRL模型,观察给药30d以及停药10d后,正常对照组、模型组、甲磺酸溴隐亭片阳性对照组、YRTJ高、中、低剂量组的大鼠血清中PRL、雌二醇(E2)、黄体生成素(LH)、促卵泡生成素(FSH)、孕酮(Pg)、睾酮(T)的激素水平。4.3药理作用机制研究采用Western Blot方法检测给药30d后大鼠垂体中PRL蛋白的表达量,以及免疫组织化学法检测脑组织下丘脑部的多巴胺D2受体(D2DR)的表达。结果1YRTJ质量标准研究1.1.定性鉴别：本实验采用TLC鉴别YRTJ中巴戟天、白芍、甘草,色谱斑点分离度良好,阴性无干扰,专属性强,简便快捷,重现性良好,耐用性好,因此该方法可用于控制YRTJ的质量。1.2.含量测定：以各对照品溶液的浓度(μg/mL)为横坐标X,峰面积为纵坐标Y作直线回归,所得的芍药苷标准回归方程为：Y=4.3997×10-SX-0.9393622,相关系数R=0.9999956(n=8),芍药苷在20.5-410μg/mL线性关系良好,样品含量不低于4.0mg/g,采用的色谱方法不受其它组分的干扰,精密度、回收率、稳定性良好,线性范围可满足含量测定的需要。2YRTJ加速稳定性研究在温度40℃±2℃,相对湿度75%±5%条件下,第0、1、2、3、6个月稳定性好,形状未有明显变化；粒度和干燥失重符合要求；微生物限度检查未检出细菌、霉菌和大肠埃希菌；制剂中所含白芍、巴戟天、甘草均可检出,芍药苷含量均不低于4.0mg/g。3YRTJ长期毒性试验3.1.一般状况观察：高、中、低剂量组与正常对照组在60d试验期以及停药14d后,外观形态均正常,活动自如,毛色光亮；进食无明显差异,60d内体重随着试验时间的延长,逐周增加,高、中、低剂量组相比正常对照组增长速度快,2周开始高、中、低剂量组均有统计学差异。大便成形,色泽正常,未见脓血便或腹泻；耳、鼻、眼、口腔无异常分泌物等情况。3.2.血液学指标：给药60d后,与正常对照组比较,高剂量组白细胞计数(WBC)升高且有显著性差异(P<0.01)；中剂量组红细胞计数(RBC)降低且有显著性差异(P<0.05),血小板计数(PLT)水平升高但无显著性差异。停药14d后,与正常对照组比较,各组均无统计学意义。3.3.血液生化学指标3.3.1.肾功能结果：给药60d后,与正常对照组相比,高、中、低剂量组尿素(BUN)水平显著下降,特别是中剂量组(P<0.001)；其余指标无显著性差异。停药14d后,所有指标与正常对照组相比均无显著性差异。3.3.2.肝功能结果：给药60d后,较正常对照组而言,高剂量组丙氨酸氨基转移酶(ALT)显著性降低(P<0.05),低剂量组总胆红素(TBIL)显著性升高(P<0.05)；各剂量组其余指标与正常对照组相比,均无显著差异。停药14d后,与正常对照组相比,低剂量组TBIL和间接胆红素(IBIL)显著性降低(P<0.05),所有指标均无显著性差异。3.4.系统尸检和组织病理学检查各组动物脏器均无肉眼可见的病理改变。给药60d后,相比正常对照组,中剂量组脾脏器指数显著性升高(P<0.05),其余指标无显著性差异；发现高剂量组心、肝、脾、肺、子宫脏器指数较其余各组有所升高,肾脏器指数有所下降。停药14d后,与正常对照组相比,各脏器指数均无显著性差异。组织病理学结果：给药60d以及停药14d后与正常对照组相比,皆未显示明显的病变区域,未见有明显的心、肝、脾、肺、肾及子宫毒性。4YRTJ药效学研究4.1.实验性HPRL动物模型研究4.1.1.垂体移植术(APG)、垂体移植术(APG)+甲氧氯普胺(MCP)、己烯雌酚法(DES)以及MCP法对比结果显示,四种方法均能得到满意的结果,其中DES法PRL水平仅升高144.47%,在四种方法中最低。APG+MCP组与MCP组造模结果相似,但APG组与APG+MCP组中,均有大鼠死亡现象发生。4.1.2. MCP给药次数及剂量进行考察：75mg(1次/d)、100mg(1次/d)、75mg(2次/d)以及50mg(3次/d)四组对比结果显示,给药15d后,四种剂量均能使PRL分泌增加,且每日总量为150mg的两组PRL水平分泌增加最高。但由于50mg(3次/d)组中,子宫/肠间或与腹膜组织间伴有轻度粘连现象,且腹壁组织常伴有增厚；而75mg(2次/d)组腹部组织偶有轻度增厚,且无腹腔粘连现象发生,故选择75mg(2次/d)作为MCP造模的最优剂量。4.2.药效学考察YRTJ可明显降低实验性HPRL大鼠血清PRL水平,并可改善因PRL异常分泌所导致的E2、LH、Pg等激素的紊乱,从而达到改善HPRL大鼠临床症状的目的。高剂量组在改善激素水平方面,与阳性对照药溴隐亭作用相似。4.3.药理作用机制研究YRTJ可减少垂体中PRL蛋白的表达,并在长期给予YRTJ后可减少下丘脑中D2DR的表达,其作用与溴隐亭相似；故可推断YRTJ可激动下丘脑D2受体,从而拮抗D2受体阻断剂的作用,达到抑制PRL分泌的作用,其具体作用机制仍需进一步实验进行验证。结论1.质量标准研究：采用TLC与HPLC测定,专属性强,重现性好,不受其它组分的干扰,精密度、回收率、稳定性良好,线性范围可满足测定的需要,可用于YRTJ的质量控制标准。2.加速稳定性研究：YRTJ在6个月试验期内,加速试验稳定性好,可根据影响因素与加速试验结果,为长期试验提供依据,并预测制剂的有效期。3.长期毒性试验：YRTJ在相当于临床用药剂量的25、50、100倍条件下,长期大剂量用药并未出现明显毒性反应,提示其临床正常剂量长期用药安全性。4. HPRL动物模型最佳制备方法：根据实验结果,筛选出连续腹腔注射MCP注射液(75mg,2次/d)作为HPRL动物模型的造模方法,为进一步进行YRTJ对实验性HPRL的药效学评价奠定了良好的基础。5.作用机制初步研究：在防治HPRL方面,发现YRTJ可产生类似溴隐亭的药理作用,对D2受体产生激动作用,拮抗MCP对其的阻断效应,从而使垂体中PRL蛋白的分泌减少,降低了外周血液循环中PRL的水平；改变因PRL增加所导致的激素紊乱,从而达到治疗HPRL,改善临床症状的作用。