多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）属于巴氏杆菌科巴氏杆菌属,根据荚膜成分分为A、B、D、E、F 5个血清群,根据脂多糖可分为1、2、3、4……16个血清型,其分离株完整血清型表示为A:1、B:2等。Pm可引起禽霍乱、偶蹄动物出血性败血症。禽霍乱主要是荚膜A、F和D血清群引起,本病分布世界各地,对家禽及野生禽类危害严重,造成巨大的经济损失。目前发现Pm的毒力因子有荚膜、脂多糖、外膜蛋白、唾液酸酶和铁调蛋白等。但利用强弱毒株差异基因的比较研究,进行毒力基因的挖掘,尚有待进一步研究。本研究旨在通过强弱毒株基因组测序技术、RNA-seq技术和突变株同源重组技术,找到禽多杀性巴氏杆菌强毒株毒力相关基因进行验证,为揭示禽霍乱致病机制和疫苗研发奠定基础。本研究以禽源多杀性巴氏杆菌强毒株PmC48-1株、Pm72-4株和弱毒株Pm731株为实验材料,对三个菌株进行全基因组测序。结果表明:PmC48-1株、Pm72-4株和Pm731株基因组全长分别为2,304,775 bp、2,259,533 bp、2,260,636 bp,G+C%含量分别为40.38%、40.28%、40.42%,预测的基因数分别为2131、2028、2068个。结合已公布的Pm70基因组序列,利用比较基因组学分析获得四个菌株间的差异基因。比较基因组学分析发现:强毒株PmC48-1株含有一个特有基因簇,通过与参考菌株Pm70基因组比较分析发现该基因簇全长44,468 bp,两端含有20 bp与基因PM_RS03305（rpL25）的3?端序列同源的定向重复序列,预测基因PM_RS03305的3?端是这段基因簇的插入位置;利用PHAST软件分析发现该基因簇包含一个完整的噬菌体序列和一个不完整的噬菌体序列,是一个噬菌体相关基因岛,编码67个Coding sequence（CDS）。提取强毒株PmC48-1株、Pm72-4株和弱毒株Pm731株RNA,进行RNA-seq分析找出强毒株PmC48-1、Pm72-4与弱毒株Pm731共同的差异表达基因,对共同差异表达基因的上调基因和下调基因分别做GO和KEGG Pathway富集分析,选取部分共同差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证。结果表明强毒株PmC48-1株和Pm72-4株与弱毒株Pm731株共同差异表达基因有190个,其中75个上调,115个下调。GO富集分析显示这些差异基因在分子功能方面主要涉及催化活性、结合、转运,在细胞组成方面主要涉及膜和细胞组成,在生物学过程方面主要参与细胞过程、代谢过程和定位。KEGG Pathway富集到的通路有碳水化合物代谢、能量代谢、氨基酸代谢、辅酶因子和维生素代谢、膜运输、信号传导、细胞运动性等通路。选取上调基因4个,下调基因8个,经实时荧光定量PCR验证,其与RNA-seq分析结果基本一致。为了进一步验证Pm强弱毒株的差异毒力基因,分别选取基因组学筛到的PmC48-1株噬菌体相关基因岛上的6个基因（PP₀0004、PP₀0009、PP₀0019、PP₀0053、PP₀0060、PP₀0068）和转录组学筛到的4个上调基因（dppA、fbpA、rsgA-2、PM0472）,共计强弱毒株差异基因10个,进行PmC48-1株单基因突变株的构建。通过同源重组技术筛选双交换突变株,分析双交换突变株的遗传稳定性、生长特性和致病性。结果表明,成功构建10个基因的重组替代质粒,筛选到4个基因（PP₀0004、PP₀0009、PP₀0019、dppA）的双交换突变株,分别命名为PmC48-1Δ4、PmC48-1Δ9、PmC48-1Δ19、PmC48-1ΔdppA。四个突变株连续传代20代后其遗传稳定性良好,体外生长曲线与野生型PmC48-1株基本一致。突变株BALB/c小鼠致病性实验结果显示,野生型PmC48-1株以10 CFU/只剂量腹腔注射小鼠,其在24 h内全部死亡,其LD₅₀<10 CFU,而突变株PmC48-1Δ4、PmC48-1Δ9、PmC48-1Δ19、PmC48-1ΔdppA分别以5×10³ CFU/只剂量腹腔注射小鼠,其在10天之内全部健活,表明四个突变株的LD₅₀均大于5×10³ CFU,毒力均明显减弱。基因注释表明PP₀0004基因编码假定噬菌体尾巴蛋白,PP₀0009编码噬菌体尾巴长度卷尺蛋白,PP₀0019编码XRE家族转录调节因子,dppA基因编码小肽转运蛋白。其中GO和KEGG分析dppA基因参与膜转运与细胞运动通路,具有转运、定位功能。本研究通过强弱毒株基因组测序技术、RNA-seq技术和突变株同源重组技术,找到并验证了禽Pm强毒株毒力相关基因4个,分别为PP₀0004、PP₀0009、PP₀0019和dppA,其中PP₀0004、PP₀0009和PP₀0019基因位于噬菌体相关基因岛上。本研究为禽霍乱致病机制的研究奠定基础,也为安全有效新型疫苗的研发提供了思路。