AiiA蛋白的表达和生物活性检测

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aiiA (N-acyl-homoserine lactonase,aiiA)基因编码的AiiA蛋白可以破坏植物病原细菌产生的信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs)信号分子,干扰该信号分子介导的群体感应,减弱致病菌对植物产生的危害。   构建携带N-酰基高丝氨酸内酯酶基因(aiiA)的重组毕赤酵母表达载体pPIC3.5K-aiiA,采用电转化方法导入毕赤酵母GS115,经营养缺陷型培养基、表型鉴定和高G418浓度筛选获得高拷贝表达盒的酵母转化子,用0.5[%]甲醇诱导表达,RT-PCR鉴定可检测到重组酵母中编码目的基因成熟肽的mRNA,SDS-PAGE和Western Blot检测结果表明,aiiA基因在毕赤酵母中成功表达,用指示菌紫色杆菌CV026检测发现目的蛋白具有降解N-酰基高丝氨酸内酯的活性。   构建了分泌型表达载体pPIC9K-aiiA,SacⅠ酶切后,将其转化到毕赤酵母GS115,经过营养缺陷型培养基、表型鉴定和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子重组酵母菌GS115(pPIC9K-aiiA),目的菌株用甲醇诱导后,上清未见有目的蛋白条带出现,浓缩后的上清也没有活性,报告菌检测胞内蛋白提取物存在活性。   将aiiA基因克隆到表达载体pET28a构建重组表达载体pET28a-aiiA,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,0.8mM IPTG诱导,SDS-PAGE和Western Blot检测结果表明,实现了aiiA基因在大肠杆菌中的表达,报告菌检测目的蛋白AiiA具有很好的降解AHLs的活性。
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