1.背景：　　镉(Cadmium,Cd)及其化合物作为一类工业毒物和环境污染物,可通过工业生产或污染水源和食物进入机体造成肾脏、肝脏、肺脏、骨质、神经、心血管和生殖等多种器官和系统损伤,甚至导致肿瘤.研究表明,镉的致癌机制十分复杂,不仅涉及到遗传机制,还涉及到表观遗传机制.目前有研究表明miRNA在镉致癌的过程中发挥作用,但其确切的角色目前还未被阐明,其调控机制也尚不清楚.　　2.目的：　　2.1 探索镉恶性转化人支气管上皮细胞(16HBE细胞)中微小RNA(microRNA,miRNA)的差异表达谱.　　2.2 筛选出差异显著的miRNA及其靶基因和基因座附近协同变化的基因,并探索差异表达的miRNA在镉致癌作用过程中的潜在作用.　　2.3 探讨镉恶性转化16HBE细胞中甲基化和乙酰化对miRNA的调控作用.　　2.4 探究镉恶性转化16HBE细胞中eEF1-δ、TIF3差异表达的调控机制.　　2.5 探索镉的亚慢性动物模型中miRNAs的表达规律.　　3.方法：　　3.1 mRNA和miRNA芯片检测　　提取细胞总RNA,进行RNA质量检测、cDNA样本合成和标记、使用Nanodrop检测荧光标记效率、在标准条件下将标记好的探针和高密度芯片进行杂交.使用相关的芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度,并将实验结果换成数字型数据保存,使用配套软件对原始数据进行分析运算.对芯片产生的数据进行均一化处理后,利用统计方法筛选出差异表达的mRNA和miRNA,以参数选择P<0.05,折叠倍率>=2筛选差异表达的mRNA,以P<0.05,折叠倍率≥1.3为参数筛选有差异表达的miRNA.　　3.2 生物信息学分析　　①利用miRanda、miRBase、TargetScan三个miRNAs相关的在线数据库查找筛选所得差异miRNA基因的靶基因;②GO分析(将靶基因向gene ontology数据库各节点映射,计算每个节点的基因数目);③pathway分析(向KEGG Pathway数据库映射,并统计基因在每个Pathway中的富集程度);④绘制miRNA与mRNA的共表达调控网络图.　　3.3 荧光定量PCR检测　　选取正常16HBE细胞和氯化镉恶性转化的35th16HBE细胞,用qPCR检测芯片数据中差异表达的miRNAs中的8个miRNAs,验证其表达规律是否与芯片结果一致.　　3.4 miRNAinhibitor和mimics技术　　选取三个有差异的miRNA(hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-301a-3p、has-miR-24-3p),设计符合条件的miRNA inhibitor和mimics序列,构建目标miRNA表达沉默序列和阴性对照序列,miRNA过表达序列和相应的阴性对照序列,对正常16HBE细胞和35th16HBE细胞进行转染.实验分为5组:inhibitor转染组(用I表示)、inhibitor阴性对照组(INC)、mimics转染组(用M表示)、mimics阴性对照组(MNC)和空白组(即未转染组).转染48h后收集每组细胞.用qPCR检测目标miRNA的表达水平验证转染效果.在检测转染效果达到要求后,对miRNAs相关的ncRNAs进行qPCR检测,分析其表达情况.　　3.5 miRNA表达沉默和过表达处理后miRNA相关的功能分析　　转染正常16HBE细胞和氯化镉恶性转化的35th16HBE细胞,然后分别采用CCK8法和流式细胞术技术分别进行增殖、周期和凋亡检测,分析3个miRNAs的调控功能.　　3.6 去甲基化和去乙酰化处理后的miRNA分析　　用5-aza-2-dc和TSA分别处理正常16HBE细胞和氯化镉恶性转化的35th16HBE细胞,分别收集处理0h、24h、48h、72h、96h的细胞,提取总RNA在进行qPCR检测hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-301a-3p和has-miR-24-3p,分析其与甲基化和乙酰化的关系.　　4.结果　　4.1 芯片检测结果　　利用统计方法筛选出差异表达的mRNA和miRNA表达谱,筛选出366个上调表达的mRNAs,132个下调表达的mRNAs;差异表达的miRNAs有3个表达上调,有5个miRNAs表达下调.　　4.2 生物信息学分析结果　　查找到三个miRNAs相关的在线数据库的目标基因,筛选其中miRNAs对应的目标基因在三个数据库都有的共有214个.其中CCM2是has-miR-27b-3p与has-miR-944的共同目标基因,has-miR-27b-3p上调表达CCM2,而has-miR-944下调表达CCM2.GO分析发现,差异表达的mRNA参与初级代谢过程、细胞代谢、细胞周期过程、DNA损伤和修复以及生物学周期等过程.差异表达的miRNA参与基础代谢、细胞的刺激性应答、下调转录本、调节内分泌过程等过程.通过Pathway分析发现目标基因与多种癌症通路、N-聚糖生物合成、错配修复、范科尼贫血以及mRNA检测通路等多种通路相关.　　4.3 筛选所得miRNA的qPCR检测结果　　8个miRNAs的qPCR结果显示,与正常16HBE细胞比较,氯化镉恶性转化的35th16HBE细胞中has-miR-27b-3p表达上调,其余七个miRNAs均表达下调,结果与芯片一致.　　4.4 miRNA表达沉默、过表达效果及其相关ncRNA的表达　　表达沉默48h后,正常16HBE细胞和氯化镉恶性转化的35th16HBE细胞中hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-301a-3p和has-miR-24-3p的表达量下降,达到表达沉默效果;过表达48h后,正常16HBE细胞和35th16HBE细胞中hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-301a-3p和has-miR-24-3p的表达量上升,达到过表达效果.　　表达沉默和过表达miRNA后,相关靶基因的qPCR结果显示,与空白对照比较,AC108039.1在沉默和过表达hsa-miR-130a-3p处理后表达皆呈下调表达,且与阴性对照的表达有差异(P<0.05);RP1-74B13.1沉默处理后表达下调;过表达后呈上调表达;RP11-124G5.1则在沉默和过表达处理后表达无明显改变;AC108039.1在沉默和过表达hsa-miR-301a-3p处理后表达皆呈上调表达,且与阴性对照的表达有差异(P<0.05);RP11.438F14.1沉默处理后表达上调;过表达后呈下调表达,且与阴性对照比较有统计学差异(P<0.05);RP11-124G5.1则在沉默和过表达处理后表达无明显改变;RP11-206F17.2、RP1-45P21.3、IFITM4P和RP11-120B7.1在沉默和过表达hsa-miR-24-3p处理后表达皆呈下调表达,且与阴性对照比较有统计学差异(P<0.05);AC090957.2和AC019109.1在沉默处理后表达下调;过表达后呈上调表达,且与阴性对照比较有统计学差异(P<0.05).4.5miRNA表达沉默和过表达处理后miRNA相关功能分析　　增殖实验结果显示,在正常16HBE细胞和氯化镉恶性转化的35th16HBE细胞中表达沉默或者过表达hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-301a-3p和has-miR-24-3p后,细胞的增殖受影响,其中沉默hsa-miR-130a-3p和has-miR-24-3促进细胞的增殖,过表达则抑制细胞的增殖;表达沉默hsa-miR-301a-3p则抑制细胞的增殖,过表达则相反.　　细胞周期检测发现,与阴性对照比较,过表达hsa-miR-130a-3p、has-miR-24-3p后,35th16HBE细胞的G0-G1期细胞计数百分比呈降低趋势,而S期则呈升高趋势;表达沉默hsa-miR-130a-3p、has-miR-24-3p或表达沉默与过表达hsa-miR-301a-3p对细胞无影响,无统计学差异(P>0.05).细胞凋亡检测发现,表达沉默或者过表达hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-301a-3p和has-miR-24-3p后,对16HBE细胞和35th16HBE细胞的总凋亡率均无明显影响,无统计学差异(P>0.05).　　5.结论：　　5.1 在氯化镉恶性转化16HBE细胞中存在miRNA差异表达谱,部分差异表达的miRNA在氯化镉恶性转化16HBE细胞和镉毒性动物模型中呈下调表达.　　5.2 在氯化镉恶性转化16HBE细胞中,miRNA具有调节细胞增殖的功能.has-miR-24-3p的差异表达可能受甲基化的调控,而hsa-miR-130a-3p和has-miR-301a-3p的差异表达可能受乙酰化的调控.　　5.3 在氯化镉恶性转化16HBE细胞中eEF1-δ的差异表达可能受hsa-miR-130a-3p与has-miR-301a-3p调控,也与RNA甲基化相关.具体的调控机制,有待后续探索验证.　　5.4 在镉毒性作用中,miRNA可能是其中的机制之一,miRNA可能是镉毒性中的新生物标志物.