论文部分内容阅读
研究背景溃疡性结肠炎(UC)是一类尚未发现其发病原因和致病机理,主要累及结直肠浅表黏膜,临床表现为黏液脓血便的疾病,在内镜下并不难以鉴别,但也是目前公认的一种无法完全根治的的非特异性炎性疾病。当前发病机制机理尚未完全明确,大量文献报道了目前广泛认为疾病的发生与机体的自身免疫功能发生了异常具有强烈的相关性,由于免疫功能过强,导致了机体发生自身攻击,产生大量免疫反应致病,因此临床治疗过程中,部分学者应用免疫抑制剂治疗取得了不错的效果。此外,其发病可能还与先天遗传因素、炎症因子的释放等非免疫性致病病因有着密切的关系。亦有研究证实,UC的发病与氧化应激因素具有一致性,氧化应激主要通过多种相关机制引起氧自由基(Reactive Oxy-gen Species,ROS)的表达释放,介导多种细胞分化、凋亡以及增殖的过程,进而引起结肠黏膜组织的损伤,是肠道炎症发生的相关机制。炎症的发生包括启动子、感受质、介质、靶组织四大部分构成,ROS的大量产生通过NLRs等类似胞内受体感受器将损伤信号传至感受细胞从而识别损伤信号,而这种信号能够引起感受细胞的兴奋和大量炎症介质的产生导致感受细胞的胞内受体被活化成为NLRP3炎性小体进而介导机体全身、局部的炎症反应。ROS可攻击细胞所有成分从而诱发NLRP3炎症小体的组装,并可直接识别或通过特定蛋白招募半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteine-requiring aspartate protease-1,caspase-1)的前体产生被活化的Caspase-1,继而可促进如白细胞介素-1 β(IL-1 β)和白细胞介素-18(IL-18)的成熟和分泌,这些炎症因子被证实为对诱发炎性肠病发病及导致其活动性加重等方面具有重要的意义,介导的肠道炎症的发生发展。炎症因子的失衡分泌会刺激CD4+T淋巴细胞过度增殖和分化进而导致机体组织免疫功能失调,致使淋巴细胞分泌白介素-2R(IL-2R),IL-2R具有促释放炎症因子的作用,导致炎症因子瀑布式释放形成恶性循环从而加重全身以及局部的炎症反,当作用于结直肠黏膜时对于局部黏膜组织就会产生炎性损伤,粘膜表面即出现充血水肿的表现。而IL-18能通过各种机制刺激Thl细胞分泌多种炎症因子,最为重要的为IFN-γ因子,其活性作用远强于其他炎症因子,IL-18同时具有增强NK细胞及CD8T淋巴细胞的毒性的作用,并促进T细胞增殖,能介导多种细胞因子及趋化因子引起炎性反应的加重。caspase-1除了分泌、增殖炎性介质的过表达外还能够起到介导程序性地细胞焦亡的作用,细胞焦亡是一种不同于正常细胞发生凋亡的促炎性死亡方式,致病因子介导细胞膜破裂后大量胞内内容物通过裂解的细胞膜流出,由于内容物的释放导致强烈的炎症反应。转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)被认为是在抵制氧化磷酸化和各类有毒介质的防御体系中扮演着关键角色。其可通过保护酶类、各种细胞因子及其黏附因子的存在,从而在各类炎症疾病发生发展过程中起到重要的抑制作用,这也是机体组织抵制氧化应激的一个不可或缺的调控因子。在正常情况下,Nrf2可以与期望结合蛋白进行组合产生作用,而当机体内受到了氧化应激或其他损伤因子影响后,这种结合显迅速与之进行分解解离,并以稳定的状态进入细胞核中形成异二聚体,诱导激活产生一系列拮抗氧化的作用。萝卜硫素(sulforaphane,SFN)又名莱菔硫素,证实是一种在十字花科内含量丰富的天然饮食性的酸性物质,可诱导激活解毒酶产生抗癌物质、调节人体的免疫力而起到抗癌、抗氧化的作用,其中在前列腺癌、肝癌、乳腺癌等多种疾病中被认为有效。SFN另一种重要作用是作为Nrf2的激动剂,可调控Nrf2的表达,大量体外实验证实,SFN具有抑制多种肿瘤细胞增殖分化并促使其凋亡的作用,可以有效地预防肝癌、肺癌等多种癌症的发生,被认为是具有良好的的抗氧化、抗癌的作用,UC是一类可以发生癌变的疾病,定期复查肠镜被认为可以有效防止结肠癌的发生,鉴于SFN的这种特性,因此本项研究选用了萝卜硫素这类抗氧化效果良好的天然活性物质。鉴于SFN的这种抗癌抗氧化的特性,是否其可通过调控Nrf2的表达从而减缓或阻止溃疡性结肠炎的发生发展。本文主要是从体外实验方面进行研究,通过混合炎症因子刺激Caco-2细胞构建UC模型模拟溃疡性结肠炎的炎症环境,探究在UC模型细胞中,Nrf2活化与NLRP3/IL-1β轴各靶基因的关系,明确SFN是否可以通过对Nrf2的调控起到对UC的保护作用。研究目的1.探索SFN是否能减缓UC模型细胞的炎症反应;2.探究在模型细胞中,Nrf2活化与NLRP3/IL-1 β轴各靶基因的关系,明确SFN是否可以通过对Nrf2的调控起到对UC的保护作用。研究方法利用IL-6、TNF-α、IFN-γ以及LPS四种不同的炎症因子混合物刺激Caco-2细胞模拟UC所处于的复杂炎性环境,以构建所需的溃疡性结肠炎细胞模型。通过不同方法对所构建的模型进行检测在特定细胞模型中的例如IL-8等炎症因子的表达情况来验证研究细胞模型是否构建成功。Nrf2 small interfering RNA(siRNA)转染 Caco-2 细胞,检测细胞中 Nrf2 与NLRP3/IL-1 β轴各靶基因的关的表达,验证Nrf2与NLRP3/IL-1 β轴的关系。用SFN预处理Caco-2细胞12h后加入四种炎症介质混合物,通过检测Nrf2、NLRP3以及炎症因子的表达,研究探讨萝卜硫素是否可以调控Nrf2通路在UC细胞模型中的保护作用机制。研究结果1.细胞模型模拟溃疡性结肠炎的炎症环境是在不同的炎症介质(主要是IL-6、TNF-α、IFN-γ以及LPS四类)的混合刺激物对结肠Caco-2细胞进行模拟刺激,利用PCR检测技术在mRNA水平检测炎症因子的表达,ELISA检测细胞上清中相关炎症因子,结果显示炎症介质的表达量均上调。2.敲低模型胞中的Nrf2基因与对照组相比,siNrf2组NLRP3以及其下游炎症因子较对照组表达上调。3.12h前SFN预处理Caco-2细胞后,加入炎症混合介质刺激细胞,Nrf2表达上调,NLRP3以及炎症因子的表达下调。研究结论1.通过利用混合炎症因子刺激结肠Caco-2细胞成功建立溃疡性结肠炎细胞模型。2.SFN能够显著改善UC的炎性环境和炎性程度。3.在UC细胞模型中Nrf2可以通过调控NLRP3/IL-1β轴各靶基因的表达减少炎症因子的产生,延缓炎症反应。4.SFN通过调控Nrf2可降低炎症因子的表达起到保护作用。5.SFN或许可通过Nrf2与NLRP3/IL-1 β途径作用成为治疗炎性肠病的新型药物佐剂,为临床提供一个新的治疗的靶点。