宫颈癌(Cervical cancer)是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤,根据2018年全球癌症统计显示,在全球女性恶性肿瘤中,宫颈癌每年的新发病例约57万,发病率为6.6%;死亡例数约31万,死亡率为7.5%。在女性肿瘤中,宫颈癌的发病率和死亡率均排在第四位,严重威胁女性的健康和生命。目前,尽管以手术和放疗为主、化疗为辅的治疗模式已经广泛地应用于宫颈癌的治疗中,但是这些传统的治疗方案对于早期患者疗效显著,对于晚期以及复发转移患者的疗效并不理想。而且,手术治疗、放疗和化疗给患者带来的并发症较多,均存在一定的局限性。因此,迫切需要探索更多有效的治疗方法及靶点以期为宫颈癌患者提供更多的治疗选择及临床获益。近年来,免疫治疗在不同的人类恶性肿瘤中得到了令人兴奋的进展。基于细胞因子的免疫治疗可以通过多种机制抑制癌细胞的侵袭和增殖,从而影响癌症的发生和发展。已有研究证实肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)具有抑制癌细胞存活的能力,对正常组织无损伤毒性,提示基于TNF-α的免疫治疗是一种有效干预癌症发展的治疗策略。但是,一些研究表明细胞因子免疫治疗的耐药性影响了其临床应用和治疗效果,而且细胞因子免疫治疗的耐药有助于癌细胞从凋亡信号中逃逸。因此,确定增强TNF-α诱导的细胞凋亡的方法是提高治疗效果的关键。线粒体是除红细胞外存在于人体所有细胞中的细胞器,除了在能量产生中起着关键作用外,也在介导哺乳动物细胞凋亡的内在途径中扮演者十分重要的角色。既往研究表明,TNF-α可以通过激活caspase-9依赖的线粒体凋亡途径诱导癌细胞凋亡。因此,我们推测基于TNF-α免疫治疗的耐药可能与线粒体凋亡调节失败有关。最近的研究证实,线粒体可以通过线粒体自噬(mitochondrial autophagy,mitophagy)维持自身的数量和质量。线粒体自噬通过LC3Ⅱ标记受损的线粒体,促进损伤的线粒体进入溶酶体,从而导致有缺陷的线粒体被清除,这种保护机制有助于肿瘤通过及时清除受损的线粒体来阻断线粒体诱导的凋亡。因此,我们认为线粒体自噬可能与基于TNF-α的免疫治疗导致的耐药有关。褪黑素主要是由哺乳动物松果体合成并分泌的一种吲哚胺类激素,对身体的多种生理过程有益。近年来,褪黑素因其在多种肿瘤细胞中的促凋亡作用引起了人们的广泛关注。研究表明,褪黑素通过各种生物学机制发挥抗增殖和促凋亡作用,对乳腺癌、结直肠癌、平滑肌肉瘤、肾细胞癌和胃肠道肿瘤起抑癌作用,是抗癌药或联合治疗的极佳候选药物。化疗药物依托泊苷联合褪黑素可提高源自急性髓性白血病患者的白血病细胞的清除率,褪黑素可以增强顺铂诱导的卵巢癌细胞毒性,促进乳腺肿瘤对阿霉素(DOX)的敏感性以及肿瘤的消退。最近的研究证实了褪黑素对线粒体自噬的抑制作用,如在急性脑损伤中,褪黑素通过调节线粒体自噬来减轻创伤性脑炎。在人类肝细胞癌细胞中,褪黑素通过改变线粒体自噬增加了肝癌细胞对ROS介导的细胞凋亡的敏感性。有关TNF-α与褪黑素协同对人宫颈癌细胞的治疗作用,鲜有资料报道。因此,本研究利用体内外研究方法分别探讨了褪黑素通过调节线粒体自噬对TNF-α诱导的宫颈癌Hela细胞凋亡的影响,并深入研究了与其可能有关的线粒体自噬信号通路,总结如下。第一部分 褪黑素对TNF-α介导的宫颈癌Hela细胞凋亡影响的研究研究目的本部分旨在研究褪黑素对TNF-α介导的宫颈癌Hela细胞凋亡的影响研究方法1.将Hela细胞分为对照组、单用TNF-α组、单用褪黑素组、褪黑素联合TNF-α组。2.采用噻唑蓝比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)及乳酸脱氢酶释放实验(Lactate dehydrogenase,LDH)检测各组对Hela细胞增殖的影响。3.通过TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(Terminal deoxynucleotidy transferase-mediated dUTP Nick End Labeling,TUNEL)检测各组 Hela 细胞凋亡的发生率。通过酶联免疫吸附测定试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测 caspase-3 的活性以及 Western blot 检测 cleaved caspase-3 的表达水平。4.通过流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测ROS的产生、线粒体膜通透性转换孔试剂盒检测线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeablity transition pore,mPTP)开放率、JC-1测定法检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)的变化、免疫荧光检测细胞中Cyt-c的表达水平。5.通过化学发光法检测腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine triphosphate,ATP)含量、Western blot检测线粒体呼吸复合物的表达、ELISA检测线粒体乳酸生成和葡萄糖摄取。结果1.MTT结果显示:TNF-α、褪黑素单独应用时对宫颈癌HeLa细胞的增殖有抑制效应,褪黑素与TNF-α联合应用时抑制率高于TNF-α单用组,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.TUNEL检测结果显示:TNF-α、褪黑素单独应用时可促进HeLa细胞的凋亡,褪黑素与TNF-α联合应用时凋亡率高于TNF-α单用组,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.ELISA及Western blot结果显示:TNF-α、褪黑素单独应用时caspase-3的活性及cleaved caspase-3的表达水平显著增加,而且褪黑素与TNF-α联合应用时caspase-3的活性及cleaved caspase-3的表达水平高于TNF-α单用组,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.TNF-α、褪黑素单独应用时可促进ROS的产生、mPTP的开放率及MMP的下降,褪黑素与TNF-α联合应用时,与TNF-α单用组比较,联合应用显著增加ROS的产生、mPTP的开放率及MMP的进一步下降;与TNF-α组单用组相比,TNF-α和褪黑素联合应用更有效地促进Cyt-c释放,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.与TNF-α、褪黑素单用组相比,褪黑素与TNF-α联合应用组可显著降低HeLa细胞中的ATP含量、线粒体呼吸复合物的表达以及葡萄糖的消耗和乳酸的产生,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1.褪黑素可以增强TNF-α介导的宫颈癌Hela细胞凋亡。2.褪黑素通过线粒体凋亡途径增强TNF-α介导的宫颈癌Hela细胞凋亡。3.褪黑素和TNF-α共同作用可以引起线粒体能量代谢紊乱。第二部分 褪黑素增强TNF-α介导的宫颈癌HeLa细胞凋亡的相关机制研究研究目的探讨褪黑素增强TNF-α介导的宫颈癌HeLa细胞凋亡的潜在相关机制,并深入研究其可能有关的线粒体自噬信号通路。研究方法1.将HeLa细胞分为对照组、单用TNF-α组、单用褪黑素组、褪黑素联合TNF-α组、褪黑素联合TNF-α和自噬激动剂碳酰氰4-(三氟甲氧基)苯腙(Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone,FCCP)处理组、褪黑素联合 TNF-α及钙/钙调素依赖蛋白激酶 Ⅱ(Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)特异性激动剂缓激肽(Bradykinin,Brad)处理组。2.采用免疫荧光对线粒体与溶酶体共染色检测线粒体自噬活性、Western blot检测线粒体自噬相关指标LC3-Ⅱ、Beclin1、P62的表达,探讨褪黑素与TNF-α对线粒体自噬的影响。3.将FCCP加入褪黑素与TNF-α联合处理的细胞中,以激活线粒体自噬,采用ELISA检测各组caspase-3和caspase-9的活性变化。4.使用siRNA(Small interfering RNA)转染的方法作用于Hela细胞,实现Parkin 的敲减,然后通过 Western blot 检测对照组、TNF-α组、TNF-α+si-Parkin及TNF-α+褪黑素组的Parkin及线粒体自噬相关指标LC3-Ⅱ、Beclin1的表达。5.将Brad加入褪黑素与TNF-α联合处理的细胞中,以重新激活CaMKⅡ途径,采用免疫荧光及Western blot检测通路相关蛋白p-CaMKⅡ和Parkin的表达。结果1.线粒体与溶酶体共染色检测结果显示:与对照组相比,TNF-α单用时,线粒体与溶酶体融合增加;与TNF-α单用相比,单用褪黑素、褪黑素与TNF-α联合应用时,线粒体与溶酶体融合减少,差异均具有统计学意义(P<0.05)。2.Western blot结果显示:与对照组相比,TNF-α单用时,自噬标记蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1表达增加同时P62表达水平降低;而与TNF-α单用相比,单用褪黑素、褪黑素与TNF-α联合应用时,自噬标记蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1表达降低,P62表达水平增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。3.ELISA结果显示:与对照组相比,TNF-α、褪黑素单独应用时caspase-3和caspase-9的活性增加;与TNF-α单用相比,褪黑素与TNF-α联合应用时caspase-3和caspase-9的活性显著增加;与褪黑素与TNF-α联合应用相比,褪黑素联合TNF-α及FCCP组caspase-3和caspase-9的活性显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。4.Western blot结果表明,与对照组相比,TNF-α组Parkin的表达水平显著增加;而与TNF-α组相比,TNF-α+si-Parkin组和褪黑素与TNF-α联合组Parkin的表达水平显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。为了进一步了解Parkin表达水平的增加是否与TNF-α介导的线粒体自噬相关,采用Western blot检测siRNA敲减Parkin后的自噬标记蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ表达水平的变化。结果显示:与对照组相比,TNF-α组Beclinl、LC3-Ⅱ的表达水平显著增加;而与TNF-α组相比,TNF-α+si-Parkin组及褪黑素与TNF-α联合应用组Bec1inl、LC3-Ⅱ的表达水平显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.Western blot及免疫荧光结果显示:与对照组相比,用TNF-α处理时,p-CaMKⅡ和Parkin蛋白的表达水平增加;与TNF-α处理组相比,褪黑素与TNF-α联合组p-CaMKⅡ和Parkin蛋白的表达水平降低;与褪黑素与TNF-α联合应用组相比,褪黑素联合TNF-α和Brad组p-CaMKⅡ和Parkin蛋白的表达水平显著增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。.结论褪黑素通过抑制CaMKⅡ/Parkin/线粒体自噬信号通路增强TNF-α介导的宫颈癌Hela细胞凋亡。第三部分 褪黑素对TNF-α介导的宫颈癌裸鼠移植瘤生长以及线粒体自噬的影响研究目的构建人宫颈癌Hela细胞裸鼠皮下移植瘤模型,研究褪黑素对TNF-α介导的宫颈癌裸鼠移植瘤生长以及线粒体自噬的影响。研究方法1.构建人宫颈癌Hela细胞裸鼠皮下移植瘤模型。2.动物分组:将20只宫颈癌Hela细胞裸鼠随机分为4组,每组5只:(1)对照组:生理盐水;(2)TNF-α单药组:TNF-α 10μg/kg;(3)褪黑素单药组:褪黑素 10mg/kg;(4)TNF-α+褪黑素联合组:TNF-α 10g/kg+褪黑素 10mg/kg。以上4组均采用腹腔注射给药,每天一次,连续12天。3.详细记录各组裸鼠的生长状况,测量裸鼠的体重及移植瘤的体积变化,绘制肿瘤动态生长曲线。给药结束后脱颈椎处死裸鼠,剥离移植瘤,称重、测量大小并取材、拍照。4.采用苏木精—伊红染色法(Hematoxylin-Eosin Staining,HE)观察各组瘤体组织病理形态的变化。5.通过TUNEL检测各组裸鼠肿瘤组织细胞的凋亡。6.通过Western blot检测线粒体自噬相关指标LC3-Ⅱ、Beclin1的表达。结果1.成功建立了人宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤模型。2.各组裸鼠移植瘤体积及瘤体重量变化 药物干预后,与对照组相比,TNF-α、褪黑素单用时移植瘤的体积减小;与TNF-α单用相比,褪黑素与TNF-α联合应用时移植瘤的体积减小更明显,差异均有统计学意义(P<0.05)。处死裸鼠后,TNF-α、褪黑素组裸鼠的瘤体重量与对照组相比降低;与TNF-α单用相比,褪黑素与TNF-α联合应用瘤体重量降低更显著,差异有统计学意义(P<0.05)。3.HE染色镜下显示,TNF-α组、褪黑素组、褪黑素联合TNF-α组的瘤体组织均出现明显的凋亡细胞及坏死组织。4.TUNEL检测结果结果显示:与对照组相比,TNF-α、褪黑素单独应用时细胞的凋亡增加;与TNF-α单用相比,褪黑素与TNF-α联合应用时细胞的凋亡明显增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。5.Western blot结果显示:与对照组相比,TNF-α单用时,自噬标记蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1表达增加;而与TNF-α单用相比,单用褪黑素、褪黑素与TNF-α联合应用时,自噬标记蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论褪黑素通过抑制线粒体自噬信号通路增强TNF-α介导的宫颈癌裸鼠移植瘤细胞的凋亡。