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一、研究背景创伤后应激障碍(Posttraumatic stress disorder, PTSD)主要是由于恐惧记忆不能正常消退(Extinction)导致。暴露疗法是治疗PTSD的常用手段之一,其实质就是促进恐惧记忆的消退。但是在Renewal, Spontaneous recovery以及Reinstatement这些特定情况下,之前的恐惧记忆又会再现,提示消退可能并不能擦除原有的恐惧记忆,只是形成了一种新的安全记忆来抑制原有恐惧记忆的再现。但近期Monfils等研究人员发现,在Extinction之前特定的时间窗内(10min-6 h)给以记忆一次Retrieval,则Extinction之后原有恐惧记忆的Renewal, Spontaneous recovery以及Reinstatement就不会发生,说明原有的记忆是可以擦除的。然而Retrieval+Extinction导致记忆擦除的机制是什么,目前仍说法不一。很多研究表明记忆的形成依赖于特定蛋白的合成。那么记忆的擦除很有可能需要降解储存记忆的蛋白。而Lee等的研究发现环境恐惧记忆Retrieval之后,海马CA1脑区突触部位蛋白的泛素化水平增加,提示泛素蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system,UPS)依赖的蛋白降解在记忆Retrieval之后的不稳定阶段发挥重要作用。因此,我们推测Retrieval+Extinction关联导致的记忆擦除与蛋白降解相关。为了验证该假设,我们采用GST-S5a pull down多泛素化分析,蛋白酶体活性检测,病毒构建等方法研究了以声音为线索的条件性恐惧记忆(Auditory fear conditioning, AFC)擦除过程中基底外侧杏仁核(Basolateral amygdala, BLA)中的蛋白降解在记忆擦除中的作用以及可能的分子机制。二、研究目的研究Retrieval+Extinction诱导的记忆擦除过程中,蛋白降解的作用以及其分子机制。三、实验结果1. Retrieval+Extinction后基底外侧杏仁核内蛋白的泛素化水平以及蛋白酶体活性增加我们通过GST-S5a pull down多泛素化分析,以及体外蛋白酶体活性检测等手段,发现在基底外侧杏仁核突触部位,Retrieval+Extinction组泛素化条带的灰度值以及蛋白酶体的荧光强度值较单纯Extinction组都显著增加(P<0.01)。2.BLA中的蛋白降解参与调控Retrieval+Extinction后AFC记忆的擦除我们使用蛋白酶体抑制剂βLac,经Retrieval+Extinction后,在测试Renewal, Spontaneous recover, Reinstatement时,动物的Freezing值较溶剂对照组明显增加(P<0.01)。接下来,我们又使用蛋白酶体激动剂Oleuropein,再给予单独Extinction,结果发现在Renewal, Spontaneous recover, Reinstatement时,大鼠Freezing值较溶剂对照组显著降低(P<0.01)。3.促进蛋白降解是Extinction之后记忆擦除的必要条件我们发现AFC获得后10分钟进行Extinction训练大鼠BLA内K48多泛素化条带的灰度值明显高于24小时后进行Extinction训练的大鼠(P<0.05)。而且在AFC记忆获得前给予βLac,则AFC记忆获得后10分钟进行Extinction训练的大鼠在Reinstatement测试时freezing值仍然较高(P<0.01)。我们又选取了另一个行为范式,即恐惧记忆获取30天后再进行Retrieval+Extinction,该行为范式后BLA内的K48多泛素化条带的灰度值明显低于AFC 24小时后给予Retrieval +Extinction组动物(P<0.01),但如果在Retrieval前,给予蛋白酶体激动剂Oleuropein,则Reinstatement测试时freezing值较溶剂对照组明显降低(P<0.01)。4.BLA中含GluA1的AMPA受体降解参与调控Retrieval+Extinction后AFC记忆的擦除我们发现GluAl的泛素化水平在Retrieval+Extinction后比单纯Extinction组显著增加(P<0.01)。Retrieval+Extinction后一个月GluAl的表达较单纯Extinction仍然明显降低(P<0.01)。5. Retrieval+Extinction后蛋白酶体活性的增加是通过激活CaMKII实现的我们检测发现Retrieval+Extinction后大鼠BLA内的CaMKII的磷酸化水平较单独Extinction明显增高(P<0.01),接下来我们使用CaMKII的抑制剂KN62抑制其在该行为范式中的活化,结果发现蛋白酶体活性明显降低(P<0.01),GluAl蛋白水平则显著升高(P<0.01),同时我们发现在Reinstatement测试时freezing值较溶剂对照组明显增加(P<0.01)。6. Retrieval+Extinction后泛素化水平的增加是通过E3酶Nedd4-1介导的我们在Retrieval+Extinction后检测Nedd4-1,发现其在BLA突触部位的蛋白量较单纯Extinction组显著增加(P<0.01)。使用Nedd4-1的干扰病毒抑制Nedd4-1表达后,即使给以Retrieval+Extinction也不能促进记忆擦除。7.BLA内蛋白的亚硝基化通过调控蛋白酶体的活化参与Retrieval+Extinction后的AFC记忆擦除我们先将一氧化氮合酶抑制剂(Nu-Nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME)注射到AFC记忆获得后24小时大鼠体内,然后进行Retrieval+Extinction与溶剂对照组相比,蛋白酶体荧光强度值显著降低(P<0.01),而泛素化修饰没有差异(P>0.1),BLA内突触部位GluAl蛋白水平升高(P<0.01),且Reinstatement测试时freezing值较高(P<0.01)。随后我们又在AFC记忆获得后30天注射一氧化氮供体(molsidomine, MOL),然后进行Retrieval+Extinction,与溶剂对照组相比,蛋白酶体荧光强度值显著增加(P<0.01),而泛素化修饰没有差异(P>0.1),BLA内的突触部位GluAl水平降低(P<0.05),且Reinstatement测试时freezing值明显降低(P<0.01)。四、实验结论我们首次发现泛素蛋白酶体系统依赖的蛋白降解在Retrieval+Extinction后的AFC记忆擦除中发挥重要作用。该过程的启动依赖于CaMKII的激活以及E3连接酶Nedd4-1的增加,最终导致突触部位重要的记忆相关蛋白GluAl的降解。BLA内蛋白的亚硝基化可能通过促进蛋白降解参与记忆的擦除。