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组织蛋白酶B（CTSB）是重要的溶酶体半胱氨酸蛋白酶，在多种生理及病理活动中发挥作用，对动物的卵母细胞成熟及胚胎发育能力有着重要影响。研究绵羊卵母细胞在体外成熟过程中CTSB活性的变化规律及其与卵母细胞发育能力的相关性，可为提高绵羊体外胚胎生产效率提供理论依据和技术措施。本研究克隆得到了绵羊CTSB基因的CDS序列，全长1008bp，编码335个氨基酸，已提交至Genbank（登录号：KC699918）。利用多种生物信息学软件预测绵羊CTSB蛋白质具有典型的木瓜蛋白酶类半胱氨酸蛋白酶的结构特征，由信号肽、前体肽及成熟肽构成，具有Cys108、His278和Asn298三个半胱氨酸蛋白酶活性位点，以及CTSB蛋白特有的闭合环（occluding loop）结构，并存在翻译后磷酸化及糖基化修饰。利用荧光底物法使用酶标仪检测绵羊卵丘卵母细胞复合体（COCs）在体外成熟过程中CTSB活性变化规律，结果表明：绵羊COCs中CTSB活性随着体外成熟时间的延长呈逐渐下降趋势，成年绵羊中，与IVM0h时COCs中CTSB活性相对荧光单位（RFU）比值（1.0000）相比较，IVM8h时降至0.7740（P<0.05），IVM16h降至0.7030（P<0.01），IVM24h降至0.3709（P<0.01）。羔绵羊中，与IVM0h RFU比值（1.0228）相比较，IVM8h（1.0267）未有显著变化（P>0.05），IVM16h降至0.7817（P<0.01），IVM24h降至0.6087（P<0.01）。IVM8h及IVM24h羔绵羊COCs中CTSB活性显著高于成年绵羊。使用激光扫描共聚焦显微镜检测成年绵羊卵母细胞及卵丘细胞中CTSB活性光密度平均值，结果显示IVM24h的卵母细胞中CTSB活性（0.0046）极显著低于IVM0h（0.0119）（P<0.01），卵丘细胞中CTSB活性（0.2175）则显著低于IVM0h（0.2960）（P<0.05）；质量差的COCs经体外成熟24h之后，卵母细胞及其卵丘细胞中CTSB活性光密度平均值（0.0439和0.4371）均极显著提高于正常质量组（P<0.01）。在成熟液中添加不同浓度的半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64，研究其抑制CTSB活性及其与卵母细胞发育能力相关性的结果表明：成年绵羊1μmol/L E-64组在IVM8h时COCs中CTSB活性显著低于对照组（P<0.05），5μmol/L及10μmol/L E-64组则极显著低于对照组（P<0.01），IVM16h各试验组均极显著低于对照组（P<0.01），IVM24h均显著低于对照组（P<0.05），羔绵羊5μmol/L E-64组各时间点CTSB活性均极显著低于对照组（P<0.01）；成年绵羊COCs在含有1，5，10μmol/L E-64的成熟液中经24h体外成熟，E-64各浓度组卵母细胞中CTSB活性较对照组并未显著降低（P>0.05），但卵丘细胞中CTSB活性则显著降低（P<0.05）；1，5，10μmol/L E-64对成年绵羊卵母细胞成熟率及卵裂率无显著影响（P>0.05），但使囊胚率较对照组提高39.8%~48.6%（P<0.05）。